慢性胰腺炎的动物模型选择*

彭晓华综述,周旭春审校

（重庆医科大学附属第一医院消化内科 400016）

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis,CP）是由各种原因引起的胰腺组织和功能的不可逆性损伤,主要表现为顽固性疼痛、胰腺内分泌和外分泌功能下降及胰石和假性囊肿的形成。近年来CP的发病率有所上升,目前认为CP不仅与过量饮酒、胆管疾病、胰腺损伤、自身免疫反应等有关,而且与遗传、吸烟、环境等有关[1],但是CP确切的发病机制仍然不明确。为此学者们设计了各种动物模型进行了大量研究,本文将其综述如下。

1 饮食诱导法

Kono等[2]用高脂饮食（200kcal·kg-1·d-1）和乙醇（17～18g·kg-1·d-1）饲养雌性Wistar大鼠8周,发现乙醇联合高脂饮食可刺激淀粉酶和脂肪酶增加,促进胰腺纤维化、腺泡细胞脂肪浸润和坏死,Ⅰ型胶原mRNA表达增加,提示乙醇联合高脂饮食可造成胰腺纤维化。近年Zhang等[3]发现单纯高脂饮食可造成CP的发生。研究者给予SD大鼠饲以高脂饮食（1%胆固醇、10%猪油、0.3%牛磺胆酸钠）10周,结果发现大鼠血中三酰甘油增加,胰腺组织超氧化物歧化酶增加,组织学上可见明显的胰腺腺泡细胞萎缩、脂质浸润、间质纤维化等慢性炎症改变,作者同时发现随着大鼠高脂饮食时间的延长,胰腺组织的α-平滑肌动蛋白（smooth muscle actin，α-SMA）、血小板源性生长因子-β（platelet derived growth factor-β,PDGFR-β）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的表达也逐渐增加。提示高脂通过促进脂质过氧化和激活胰腺星状细胞,促进胶原合成,导致CP发生。饮食法诱导的CP模型采用非侵入性方法,操作简单,适合于探讨CP发病机制及评价药物的干预作用,但该模型成模时间较久。

2 自发性胰腺炎

用富含蛋白质、脂肪的特殊饲料MB-3（其中蛋白质28.1%、脂肪6%、碳水化合物48.8%）饲养雄性WBN/Kob大鼠,12周后大鼠出现CP表现。Reding等[4]用普通饮食饲养雄性WBN/Kob大鼠12周发现,胰腺腺泡细胞水肿、凋亡,细胞间质有淋巴细胞、中性粒细胞浸润,TGF-β1在腺泡细胞及导管上皮细胞表达增加,16周时胰腺小叶融合损伤并有纤维组织替代。Sakaguchi等[5]最近的研究表明,WBN/Kob大鼠用普通饮食饲养8周后即可出现小叶内纤维化等CP的改变。该模型的机制可能是WBN/Kob大鼠对TGF-β1高度表达,后者可以引起胰腺纤维化。该模型胰腺中可见大量的淋巴细胞浸润,受损的胰腺组织中CD8+细胞浸润和组织特异性的IgG表达增加,提示与自身免疫反应有关。

该模型方法成熟,操作简单,成功率高,但缺点是对大鼠的类型有特殊的需求,只有WBN/Kob大鼠才会出现CP,主要用于研究自身免疫性胰腺炎。

3 腹腔注射法

3.1 二乙基二硫代氨基甲酸盐（diethyldithiocarbamate,DDC）腹腔内注射法 Matsumura等[6]向雄性Wistar大鼠腹腔内注射DDC 500mg/kg,每周2次,2周后可见胰腺小叶内和小叶间纤维化并伴有腺泡细胞萎缩,但其他脏器没有纤维化改变。其原理为DDC可抑制铜/锌超氧歧化酶（Cu/Zn-SOD）的活性,脂质过氧化物增加,通过反复的氧化刺激导致胰腺纤维化。此法方法简单、成模时间短,但是动物并发症较多,死亡率高。国内有学者[7]采用DDC递增法及延长成模时间模拟CP渐进性的发病过程,同样建成胰腺纤维化模型,降低了并发症的发生率和大鼠的死亡率。

3.2 雨蛙肽腹腔注射法 近年来反复发生的急性胰腺炎、胰腺的损伤修复,在CP发生过程中的作用越来越受到关注。雨蛙肽可以刺激胰腺外分泌,引起胰腺腺泡细胞自溶。Perides等[8]通过饮食、乙醇和雨蛙肽共同作用制备小鼠的CP模型,作者给雄性C3H小鼠予以高脂高蛋白饲料8周后,每隔3d向腹腔内注射大剂量雨蛙肽,每小时一次,连续7次,可见腺泡细胞周围有胶原沉积；定量逆转录-聚合酶链反应显示α-SMA、TGF-β、Ⅰ型胶原纤维和血浆1型组织基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIM P-1）的表达明显增加。该模型主要用于研究胰腺纤维化的影响因素。Gukovsky等[9]给雄性Wistar大鼠乙醇饲养8周,同时给予腹腔内注射雨蛙肽（20μ g/kg）,再给予20mg/kg环孢菌素A,发现核因子-к B（nuclear factor kappa B,NF-κ B）表达增加,胶原、基质金属蛋白酶2、9表达增加,胰腺星状细胞激活。此模型中雨蛙肽造成大鼠胰腺损伤,在胰腺损伤修复过程中,环孢菌素刺激血清中转化生长因子水平升高,肌成纤维细胞增生,胶原酶活化及胶原形成,乙醇加重上述损伤,促使胰腺纤维化发生。雨蛙肽腹腔内注射法具有操作简单、成模时间较短等优点,可用于探讨CP的发病机制和病理生理改变,但是该药物价格较贵。

3.3 精氨酸腹腔内注射法 有研究者给雄性SD大鼠每日腹腔内注射300mg/100g L-精氨酸3周,然后每隔3d腹腔内注射同等剂量L-精氨酸3周,实验结束时大鼠胰腺腺泡细胞萎缩、炎症细胞浸润、纤维化、脂质过氧化物和一氧化氮增加。其原理是L-精氨酸影响脂质过氧化,促进CP的发生和发展[10]。

3.4 聚肌胞腹腔内注射法 Soga等[11]每3天给具有自身免疫倾向的MRL/Mp小鼠腹腔内注射一次聚肌胞（poly I∶C）,12周后胰腺实质为脂肪组织所代替,可见单核细胞和淋巴细胞浸润等慢性炎症改变。作者发现Toll-3受体通过Fas/FasL介导的细胞毒性作用参与CP的发生。该模型是研究自身免疫性胰腺炎的较好模型。

4 胰管内注射法

Kataoka等[12]把黏合剂（成分为玉米蛋白、油酸、三酰甘油、亚油酸）逆行性注射至大鼠胰管内制备CP模型。6个月时可见胰腺腺体萎缩、不规则纤维化、CP模型形成。此模型实验时间较长,动态观察较困难,适合于小导管阻塞引起的CP发病机制的研究。

Yamaguchi等[13]给予Wistar大鼠导管内注射3%牛磺胆酸钠,1周后可见胰腺腺泡细胞受损、炎症细胞浸润,14d后纤维结缔组织增生,Ⅳ型胶原、MMP-2mRNA表达增加。Hu等[14]通过胰管内注入三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenenze sulfonic acid,TNBS）也成功诱导了大鼠CP,作者研究发现sonic hedgehog信号通道在该动物模型中被激活。胰管内注射可以通过破坏胰管上皮细胞的黏膜屏障,产生氧自由基,导致对胰管上皮细胞的毒性作用。该模型重复性较好,病变持续时间长,可反映急性炎症向慢性炎症转变的动态过程,符合人类CP演变的一般规律。但是造模过程中大鼠易并发感染,死亡率较高,而且胰管内注射技术操作要求高。

5 胰导管结扎法

Kishi等[15]结扎大鼠胰管,7d后胰腺组织的-SMA表达增加,出现胰腺萎缩、纤维化和慢性炎症细胞浸润,表现为典型的CP特征。有学者用结扎法同样造成猫、猪的CP模型。Yamamoto等[16]结扎鼠胆总管,在胆胰管插入导管造成胰管内高压,2周后主胰管内可见导管内栓子形成,小叶内和小叶间纤维化以及炎症细胞浸润,α-SMA和Ⅰ、Ⅲ型胶原表达增加,逆转录-聚合酶链反应显示TGF-β1mRNA增加。此类动物模型通过结扎胰管,造成胰管内压力增高,导致胰液逆流、腺泡细胞损伤,从而激发机体对损伤的修复,出现炎症细胞浸润及纤维化。该模型适用于CP发病机制和治疗措施的研究,但手术具有一定的创伤,操作有一定难度。

6 静脉注射法

6.1 二氯二丁基锡（dibutyltin dichloride,DBTC）静脉注射法Inoue等[17]将DBTC注入大鼠右颈静脉,检测注射后第7、14、28天后胰腺组织的病理改变,发现在第7天后可见巨噬细胞浸润及胰腺实质纤维化,第28天后可见小叶间纤维化,腺泡萎缩明显,假腺管形成,组织中的胰酶、淀粉酶含量均下降,病变随着时间延长而逐渐加重。该造模方法成功率为80%。Vera-Portocarrero等[18]在给大鼠注射DBTC的同时,给予10%的乙醇喂饲,2周后即观察到胰腺内胶原纤维沉积。其原理可能是DBTC破坏腺泡细胞和胰管上皮细胞,诱导胰腺炎发生,坏死细胞阻塞胰管,导致胰管扩张、胰腺小叶结构破坏,造成间质纤维化。该方法操作简单、经济,动物死亡率低,造模成功率高,已广泛应用于CP的发病机制、病程演变及治疗研究中。

6.2 内毒素静脉注射法 长期饮酒者中CP的发生率增加,而长期饮酒者中常有高内毒素血症发生。乙醇喂养的大鼠,血浆中内毒素水平明显升高[19]。Vonlaufen等[20]给SD大鼠含乙醇的饲料喂养10周后,每周1次尾静脉注射内毒素,共3次,可见明显的胰腺腺泡细胞空泡化和坏死,炎症细胞浸润,纤维结缔组织增生,α-SMA表达增加,羟脯氨酸增加,说明高内毒素血症对CP的发生有促进作用。该模型可用于CP的发病机制研究。

7 病毒感染法

B族柯萨奇病毒（Coxsackievirus B,CVB）已经被证实与胰腺的慢性炎症有关。有学者用8周龄雌性BALB/cByJ小鼠,腹腔内感染CVB4-V。结果显示,CVB4-V可以诱导小鼠胰腺损伤向CP发展,出现持续的炎症细胞浸润、纤维结缔组织增生[21]。Jerrells等[22]在给C57BL/6小鼠摄入6～8周乙醇的基础上腹腔内注射柯萨奇病毒诱导了CP,16d后显示胰腺有广泛的胶原沉积。SM A、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）表达增加。有报道指出乙醇摄入可以抑制免疫反应而增加对病原体的敏感性,由于长期摄入乙醇导致病毒感染迁延不愈,促进CP的发生。在病毒诱导的CP中,IL-10的表达增加[23]。有学者发现,在柯萨奇病毒诱导的胰腺炎中,细胞生长、血管再生和凋亡抑制相关基因表达增加,提示CP与胰腺癌存在某种程度的相关性。该模型可用于寻找纤维化发生的分子病理学机制及用于CP与胰腺癌关系的研究。

8 转基因动物模型

在遗传性胰腺炎中可检测到阳离子胰蛋白酶原基因（protease serine 1,PRSS1）突变。Archer等[24]研究发现通过弹力蛋白酶启动子在胰腺腺泡细胞表达突变PRSS1-R122H的转基因鼠。在转基因鼠的胰腺出现早期的胰腺腺泡细胞损伤和炎症细胞浸润,随着转基因鼠年龄的增加,可见胰腺纤维化和腺泡细胞退行性改变。研究者认为PRSS1突变是遗传性CP的病因,持续的胰腺损伤可引起CP发生。转基因CP模型可能是CP动物模型研究发展的一个方向。

9 其他

微血管的改变在CP的发生中占有重要地位。将聚苯乙烯微球注入脾动脉远支或结扎供应胰腺左叶的血管分支,造成胰腺慢性缺血可诱导形成CP。此类模型重复性及稳定性好,但所需人力较多,适合探讨胰腺血循环障碍在CP发生、发展过程中的作用机制。采用部分结扎或切断+结扎背胰管或背-腹胰管交通支的方法建立的胰腺分裂模型为胰腺分裂症合并CP患者的外科治疗提供了依据。但制备此模型时手术操作对胰腺的创伤大。

10 小结

上述动物模型各具特点,有些动物模型适于胰腺炎病因学的研究,有些动物模型更适于胰腺炎形态学改变的研究。研究者可根据研究条件和研究需要选择不同的动物模型来复制CP病程中的某一阶段,观察和探讨CP的各方面情况。研究能够较准确复制人类CP,且操作简便、易重复、实验成本低、周期短的模型制备方法,必将成为未来CP实验研究中的方向。

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