脉冲电场不可逆性电击穿在肿瘤治疗中的研究进展

张 琴综述,熊正爱审校

（重庆医科大学附属第二医院妇产科 400010）

据世界卫生组织统计,全世界每年死于肿瘤的人数多达700万,近20年期间,恶性肿瘤的死亡率呈上升趋势,共增长了29.4%；在死因中的构成比自12.6%升至17.9%。尤其是在发展中国家,恶性肿瘤已经成为威胁人类生命健康的主要疾病。传统的治疗方法如手术、化疗、放疗、热疗、生物治疗等由于受适应证、禁忌证和不良反应等因素的限制,治疗效果仍不理想。脉冲电场不可逆性电击穿（irreversible electroporation，IRE）由于其作用时间短、非热效应、操作相对简单、可能适用于免疫抑制者等独特之处及其在肿瘤治疗中展现的良好前景逐步受到国内外研究者的关注,有可能由脉冲辅助治疗转变为独立的肿瘤局部治疗手段。

1 IRE疗法的来源

Sale和Hamiton[1]在1967年首次提出电场会导致细胞死亡或减少的观点。美国MIT学者Weaver[2]经过长期的研究发现,在正常的生理功能状况下,细胞膜能较好地阻碍离子和亲水分子的传输。但是当施加强度为kv/cm、持续时间为s～ms级的电脉冲刺激细胞膜时,细胞膜会出现微孔,同时电导率发生改变,这种由电脉冲产生的细胞膜渗透性增加被解释为细胞膜暂时通透性结构改变或微孔的形成,通常称之为可逆性电穿孔。当增加电脉冲剂量则细胞膜出现不可恢复的破裂使细胞死亡时,此为不可逆性电击穿（IRE）。产生电穿孔后,细胞膜的渗透性极大地增强,有利于细胞吸收药物分子、基因物质、蛋白质或其他大分子等,而对细胞核等膜内细胞器没有任何影响。根据这个特点,日本学者Okino和Mohri[3]创立了电化学疗法,即采用电脉冲辅助化疗药物如博来霉素等治疗肿瘤。其治疗机制是一定剂量的短时电脉冲导致肿瘤细胞膜电穿孔,使得细胞膜的电导率和粒子渗透作用剧增从而促进化疗药物的运送,这种方法只需相对较少剂量的化疗药物就能较高效、低毒性地杀死肿瘤细胞,提高了化疗药物的杀伤力。此外它还可用于肿瘤的基因疗法、分子生物学上的DNA电转染、促进细胞电融合等。1999年Hofmann等[4]总结了将电穿孔技术成功应用于头颈癌治疗的经验。在电穿孔疗法实施的30多年间,IRE可导致细胞死亡这一现象仅仅被视为可逆性电穿孔治疗的不良反应。近些年来,学者们开始将脉冲电场不可逆性电击穿作为一种单独治疗手段进行研究。若可行,这种治疗不需注入药物或其他物质,即可达到杀死肿瘤细胞的目的。此法简单,也免去了患者的化疗痛苦及不良反应,因此具有巨大的临床应用前景。

2 IRE治疗肿瘤的主要作用机制

2.1 不可逆性电穿孔效应 姚成果和孙才新[5]从细胞的物质结构阐述为在很强的电场力作用下,细胞膜和核膜会产生电穿孔,周期性的陡脉冲使微孔难以愈合。其结果是有可能引起微孔量滚雪球似的增加,对细胞膜和核膜的膜结构造成不可恢复性破坏。光镜、电镜的观察结果充分证实了这种预测。Rubinsky[6]认为细胞膜发生不可逆性电击穿最终细胞坏死是IRE疗法的主要作用机制。Yang等[7]实验证实瞬间高电压脉冲刺激下,细胞膜上形成暂时、可逆性微孔,在脉冲取消后多数情况下微孔会关闭,不会对细胞造成影响。随着脉冲剂量的增加,细胞膜、核膜等处于不断的充放电动态过程,在膜及其周围形成电场。细胞膜的介电常数与周围原生质介电常数不等,必然存在作用于膜上的电场力,使细胞膜厚度不断变薄,最终导致细胞发生不可逆性电穿孔。

2.2 凋亡效应 早前,Karl等[8]研究指出,IRE能通过下调Bcl-2/Bax表达的比值,造成细胞器内促凋亡因子的释放,诱导细胞凋亡。Beebe等[9]认为凋亡可能是继细胞膜不可逆性电穿孔数十分钟后脉冲对细胞的迟发效应,通过调节细胞信号传导诱导凋亡。近来,Tang等[10]观察到,陡脉冲作用后细胞内钙离子浓度增高,细胞发生凋亡,并用透射电镜观察到了典型的凋亡细胞形态。

2.3 免疫效应 研究表明,免疫功能低下者容易引起恶性肿瘤,同时肿瘤细胞可诱导产生免疫抑制因子,从而降低机体的免疫功能。Miyazakis等[11]认为脉冲治疗能激发机体 T细胞依赖性和肿瘤特异性保护性免疫反应。Mi等[12]的一项对陡脉冲治疗后荷瘤鼠免疫功能影响的实验发现,陡脉冲电场能增加T淋巴细胞、NK细胞的免疫活性,增强巨噬细胞分泌TNF-α的能力,从而导致荷瘤鼠机体细胞免疫功能增强。

2.4 抗血管和淋巴转移效应 肿瘤细胞通过血管和淋巴转移是影响恶性肿瘤预后的重要因素。Mi等[13]在动物实验中发现,陡脉冲可破坏肿瘤营养血管和毛细淋巴管,使其栓塞并凝固性坏死,下调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）A和促淋巴管生成因子VEGF-C水平。李均和杨孝军[14]用美兰灌注后发现,陡脉冲作用后的癌组织边缘模糊,无线样或环状的淋巴管,双重染色靶区内未见任何呈阳性反应淋巴管,仅见毛细淋巴管碎片样结构。Jarm等[15]发现,即使将电极插入肿瘤周围正常组织亦能抑制肿瘤生长,并证实是由于脉冲引起肿瘤周围血流灌注减少所致。

3 IRE治疗肿瘤的国内外研究现状

IRE疗法治疗肿瘤较传统疗法有许多优点,例如它适于那些不能切除的肿瘤从而保留重要的功能性组织；靠近关键器官（如心脏等）的肿瘤如采用手术治疗或放疗均会导致该器官永久性功能丧失；对传统的化疗、手术或放疗后均无效的肿瘤细胞；它还能减少原位瘤治疗后复发的可能性等。因此,可以预见脉冲电场不可逆性电击穿技术治疗肿瘤这一前沿性的交叉性技术具有良好的发展前景。

Miller等[16]将脉冲电场作用于人肝癌细胞 HepG2,证实脉冲电场对肿瘤细胞确有杀伤作用,发现IRE是一种不同于射频消融、高强度聚焦超声等治疗方法的非热效应的物理治疗方法,热效应在脉冲电场中的抑瘤作用被排除。M aor等[17]和Maor等[18]将脉冲电场直接作用于鼠左颈总动脉,于28d后观察发现血管壁间质成分结构完整,没有出现动脉瘤、动脉破裂、血栓形成等并发症,血管内皮层有少量内皮细胞重建,新形成的内膜层变薄,这一发现也有可能为气囊血管成形术后冠状动脉再狭窄的治疗开辟新的途径。Onik等[19]在超声介导定位下将脉冲电场作用于小猎犬前列腺,作用区域邻近或包括尿道、直肠、血管神经束,得到的结论是邻近坏死区域的尿道黏膜、血管神经束完整,直肠无瘘管形成。Al-Sakere等[20]在C57B1/6鼠皮下移植瘤治疗过程中发现脉冲电场非选择性杀灭靶区内包括免疫细胞的所有细胞,靶区外的免疫细胞由于脉管系统的破坏不能对肿瘤区域起到免疫作用,陡脉冲对正常免疫功能和免疫抑制的肿瘤鼠治疗效果是一致的,结合脉冲电场改善机体免疫功能的效应,脉冲电场有望应用于治疗免疫抑制的肿瘤患者,并取得良好的疗效。Neal和Davalos[21]将脉冲电场作用于人乳腺癌M DA-MB-231细胞,测得其不可逆性电击穿的电场阈值基线,通过三维数字预测治疗模型的模拟,证明能够治疗较大范围的不均质的靶区,且没有明显的热效应,具有成功治疗早期乳腺癌的潜在可能性。

Yao等[22]和Mi等[23]用陡脉冲治疗仪治疗了多种恶性肿瘤手术离体标本,包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌、直肠癌等,治疗前后组织学观察显示对照组癌细胞生长活跃,细胞密集,间质少,核大染色深,而治疗组癌细胞边界不清,胞质融合,核固缩、碎裂,肿瘤血管变性坏死、血栓形成。同时实验还发现,脉冲参数的选择及相应的电场分布对组织中是否残存癌细胞有重要影响,这说明疗效与陡脉冲电场的治疗参数有关。李大强和熊兰[24]将陡脉冲作用于20例新鲜离体肿瘤组织,肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌、直肠癌、横结肠癌、膀胱癌。不同类型肿瘤分别施以不同参数后,证实了陡脉冲治疗上述肿瘤的有效性。董晓静和胡丽娜[25]通过比较陡脉冲治疗前后荷瘤兔的肝肾功能、血常规、心电图的变化,证实了陡脉冲治疗的安全性。凌晓娟和熊正爱[26]、杨晓燕和熊正爱[27]证实陡脉冲作用于在体兔肝肿瘤组织坏死后区面积随着脉冲参数的变化而变化,呈明显的量效关系,坏死轮廓与电场分布仿真基本吻合,治疗后荷瘤兔生存期明显延长。综上所述,目前大量离体或在体的细胞和动物实验已进一步证实了IRE的作用机制及其治疗肿瘤的可行性、有效性及安全性,为临床试验提供了充分的理论依据。

4 小结

脉冲电场不可逆性电击穿的种种独特之处展示了其在肿瘤治疗中的良好前景,美国学者Karl H.Schoenbach教授曾于2004年在《Nature》预言脉冲电场将在近几年内有望实现临床试验并逐步得到应用。尽管国内外的学者对脉冲电场不可逆性电击穿做了大量的实验和理论研究工作,但脉冲电场对肿瘤细胞的不可逆性电击穿效应及其抑制在体肿瘤增殖的规律和机制,针对不同脉冲治疗方式的“窗口效应”以及最佳治疗剂量的合理优化、脉冲治疗的分子生物学机制及其生物医学安全性和有效性评价等方面有待得到进一步的突破。

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