基因芯片技术在休克中的应用

俞晓军，胡志前

基因芯片(gene chip)又称DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)等等，是现代计算机科学、光电物理学、材料学、分子生物学及微电子技术等相关学科高速发展和相互结合的产物，它具有高度的并行性、高效率、高通量、微型化、自动化等特点，是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展之一。1991年Fodor等［1］首次提出了DNA芯片的概念，决定将硅技术与生物学技术融合在一起，借助半导体技术进行芯片研制，解读生命有机体在长期进化中累计下来的浩瀚基因信息;1994年美国Affymetrix生物公司的科研人员发明了DNA芯片原位合成技术［2］;1995年第1块以玻璃为载体的基因芯片在美国Stanford大学诞生，同年Stanford大学的Schena等［3］发表了第1篇基因微矩阵的论文;1996年美国Affymetrix生物公司制造出世界上第1块商业化的基因芯片，标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的高速发展时期。美国科学促进会将生物芯片评为1998年的十大科技突破之一，认为生物芯片技术将是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。近年来，随着各学科相关技术的不断进步，基因芯片技术的应用范围不断扩大，在生命科学研究的多个领域中得到了广泛的应用。尤其是2001 年人类基因组计划(humangenome project，HGP)［4－5］测序工作完成后，基因芯片现已成为后基因组时代基因功能分析的最重要的技术之一。本文将重点对基因芯片技术在休克领域里的应用做一综述。

1 基因芯片技术简介

基因芯片就是在某种固相载体上(一般为1cm2左右的玻片、硅片和尼龙膜)按照特定的排列方式高密度而有序地排列大量序列已知的cDNA或寡核苷酸片段，形成DNA微矩阵，将样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR等技术进行扩增和体外转录，然后用不同荧光素标记序列或样品(DNA或cDNA)，使之与芯片上已知的探针序列进行杂交，之后将支持物上未发生互补结合反应的片段洗去，通过激光共聚焦显微镜扫描，借助计算机系统对荧光信号强弱的分析处理，推测出样品中大量相关基因的定量信息，从而对基因的序列及功能进行研究。基因芯片技术的基本原理就是碱基互补、分子杂交［6］，其本质与 Southernblot一致。但 Southernblot是将待测样品固定于尼龙膜上，与1个特定的经标记的DNA探针杂交，每次只能对1个靶序列进行检测;而基因芯片技术则是将大量的DNA探针固定于固相基质上，与待测的经标记的DNA样品杂交，因此只需1次实验，便能够将成千上万的基因表现的形式记录下来。所以说，与其他基因表达的检测分析技术相比，基因芯片具有高效、快速、自动化、微型化、高通量、高度并行性及高度敏感性等优点。

目前，基因芯片在生物医学的多个领域得到了广泛的应用。如基因表达谱分析，DNA序列测定，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测［7－8］;药物筛选和药理学研究［9］;病原生物学的检测［10］等等。值得一提的是，在疾病的诊治中，基因芯片已被广泛用于包括肿瘤、遗传性疾病、传染性疾病、创伤与修复等在内的几乎所有病种中，涵盖了疾病的预防、诊断、治疗、预后等各个方面。随着疾病基因组研究的兴起，运用基因芯片寻找各种疾病相关基因的研究会不断增多，从基因水平去认识和治疗疾病也会成为未来医学研究中的热点之一。此外，基因芯片在食品安全检测、司法鉴定、环境科学、军事科学、农林科学等众多领域都取得了丰硕的成果。

总的来说，基因芯片经过十余年的发展和改进，已经逐步成熟。相信在不久的将来，基因芯片这项技术在人类的疾病诊断治疗和健康管理等众多领域可以发挥更为重要的作用。有人说它是后基因组时代研究多基因综合调控平衡以维持生命表型等内在规律的最佳手段［11］。随着新材料、新技术的不断开发，基因芯片技术一定会得到进一步的完善和发展，对人类的生存和发展产生不可估量的影响。

2 基因芯片技术在休克中的应用

查阅近年来的文献发现，尽管基因芯片技术在很多领域受到热捧，但在休克的研究中却较少，有据可查的文献只有10余篇。下面就将基因芯片技术在休克中的应用做一综述。

2．1 基因芯片在单纯失血性休克相关机制研究中的应用Sunder等［12］在定容失血性休克的大鼠模型中利用cDNA芯片技术检测了失血性休克后1、4、24小时肝脏与应激反应相关的差异表达基因，并同时检测了与肝脏损伤相关的各种酶指标的变化和肝细胞凋亡的情况。研究结果显示，在全部23个待检的与应激相关的基因中，c-jun、c-myc、热休克蛋白25(Hsp25)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)4种基因在各组中均无表达，超氧化物歧化酶1(SOD1)和瞬时受体电位离子通道蛋白-2(TRPM-2)在各组中表达量最高;从时间点分析，失血后1小时组与对照组相比有13个基因出现了差异表达，其中差异倍值＞2的有6种，p53是惟一1个下调表达的基因;失血后4小时组与对照组相比有10个基因出现了差异表达，而此时p53转变为上调表达;而到了失血后24小时时仅有4个基因出现了差异表达。经分析后认为，失血性休克引起的大鼠体内与应激相关基因的变化与肝细胞的生存和死亡都有关系，而这两者之间的平衡关系到最终细胞的生与死。这些基因之间存在着复杂的相互调节网络，如果可以进一步阐明它们之间的相互作用并用药物加以干扰，可能会对休克的治疗有益。

Lagoa等［13］在失血性休克的大鼠模型中利用基因芯片技术检测了与休克中肝脏损伤相关基因的表达变化。该研究发现，纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)在失血性休克后大鼠肝脏中呈现高表达，这种表达变化与体内纤维蛋白降解产物及白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)等无关，而与转化生长因子-β1(TGF-β1)、细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化等相关，因而推测PAI-1通过干扰肝细胞生长因子的正常表达加重了休克时肝细胞的损伤。

Feinman等［14］利用基因芯片技术研究了创伤失血性休克中肺组织损伤相关基因表达的差异。研究发现，在休克后3小时时，大鼠肺组织中有139个基因出现了差异表达，其中42个基因与急性肺损伤相关，上调表达的主要有L1反转录因子、鸟嘌呤脱氨酶等，下调表达的主要有过氧化氢酶、超氧化物歧化酶1等，这些差异表达基因的生物学功能大部分与细胞应激反应相关。

Zamora等［15］利用基因芯片技术分析了失血性休克大鼠肝脏一氧化氮(NO)诱导的相关基因表达的变化。研究发现，当增加一氧化氮合酶的活性后，大约有200个基因出现了差异表达，这些基因所编码的蛋白参与了促炎转录因子、细胞因子、细胞因子受体、细胞增殖以及细胞凋亡等多种生物学功能的信号传导途径。iNOS可以促进大鼠肝细胞的抗炎和抗凋亡能力，但同时也会抑制细胞的增殖和蛋白质的合成。iNOS会刺激应激相关蛋白的高表达，其中包括亚铁血红素合成酶-1(HO-1)，HO-1已被证实在肝脏的缺血再灌注中呈现高表达，当iNOS含量降低时，会加重肠缺血再灌注情况下肝细胞的凋亡，这与此时HO-1的低表达相关。因而得出结论，NO和HO-1在失血性休克中起到十分重要的作用。

2．2 基因芯片在失血性休克+复苏相关机制研究中的应用Shih等［16］在定压失血性休克+复苏的大鼠模型中利用cDNA芯片技术检测了失血性休克+复苏后2小时肺脏的差异表达基因。研究结果显示，与对照组相比，休克组大鼠肺脏有98个基因上调表达，11个基因下调表达，这些基因的表达产物多与炎症反应、信号传导、蛋白质的活化、氧化应激、免疫抑制以及细胞凋亡有关。

Alam等［17］在定压失血性休克+复苏的大鼠模型中利用cDNA芯片技术检测了失血性休克+复苏后3小时脾、肝、肺、肌肉中的差异表达基因，并同时检测了乳酸林格氏液(LR)、血浆和7．5%高张生理盐水(HTS)3种不同液体复苏策略对于基因表达的影响。研究结果显示，在全部1176个基因中，与对照组相比，休克复苏后肝脏有63个差异表达基因，其中42个上调，21个下调;肺脏有57个差异表达基因，其中42个上调，15个下调;脾脏有22个差异表达基因，其中20个上调，2个下调;肌肉有25个差异表达基因，其中10个上调，15个下调。从不同的复苏策略分析，LR组有51个差异表达基因，其中36个上调，15个下调;血浆组有68个差异表达基因，其中44个上调，24个下调;7．5%HTS组有48个差异表达基因，其中34个上调，14个下调。这项研究对休克复苏后4个脏器的基因表达变化做了全面的检测，并强调了不同复苏策略对于细胞在休克刺激下的病理改变中所起到的作用。

Moran等［18］在创伤失血性休克+复苏的大鼠模型中利用基因芯片技术检测了创伤失血性休克后大鼠肺脏凋亡相关基因的变化及IL-6治疗后的影响和机制。研究发现，创伤失血性休克会诱导大鼠肺上皮细胞的凋亡，并出现了87%的凋亡相关基因的表达变化;而予以 IL-6治疗后，可以使75%的因休克诱导的凋亡相关基因表达恢复正常化;当予以转录激活因子3(Stat3)阻滞剂后，会大大降低IL-6的治疗作用，使65%的原本由IL-6治疗恢复正常表达的凋亡相关基因重新出现异常表达。因此得出结论:创伤失血性休克可以诱导大鼠肺上皮细胞的凋亡，其程度与低血压持续的时间相关，IL-6可以通过活化信号转导和Stat3的途径来调节凋亡相关基因的转录和表达，对抑制由休克导致的肺细胞的凋亡有重要作用。

2．3 基因芯片在休克治疗研究中的应用 Boqner等［19］利用基因芯片技术，通过检测失血后的输血治疗对多发伤患者单核细胞信使RNA基因表达的影响，研究输血治疗对于患者免疫应答功能的影响及其机制。其研究发现，失血后接受大量同型输血治疗的患者，其单核细胞信使RNA有224个基因出现差异表达;而在失血后接受非同型输血治疗的患者，其单核细胞信使RNA有331个基因出现差异表达。这些差异表达基因的功能分析提示多与AKT/PI3激酶途径、有丝分裂活化蛋白激酶、泛素及多种炎症调节通路有关。该实验结果说明，对多发伤患者予以输血治疗会导致单核细胞信使RNA基因表达的变化，输血是影响多发伤患者预后的独立影响因素之一，对于输血的严格管理有助于多发伤患者的恢复。

Alam等［20］在定压失血性休克的大鼠模型中，利用基因芯片技术研究了低体温对重症休克治疗的影响。研究发现，低体温(15℃)可以明显降低重症失血性休克大鼠体内乳酸的含量，并可有效增加大鼠的生存率。低体温组与对照组相比，有571个基因出现差异表达，其中384个基因上调，187个基因下调。差异基因的功能分析提示，这些基因参与了12条重要信号传导通路的调节，其中与急性期反应物相关的基因，如IL-6、IL-10、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等均以上调表达为主，而与代谢途径相关的基因则以下调表达为主。差异倍值最大的是过氧化物酶增值激活受体γ，它编码转录辅助激活蛋白，与线粒体生物功能、酯类及肝脏其他代谢相关。

总之，休克是体内多基因参与的一个复杂的病理变化过程，时至今日，人们仍未完全阐明休克发生发展的相关机制，这也给休克的治疗带来了很大的困扰。基因芯片作为当代分子生物学最先进的技术手段之一，为休克的研究提供了有力的支撑。目前，基因芯片用于休克的研究还不是非常广泛，而且绝大部分研究还是着眼于不同的治疗手段对于休克时不同器官功能的影响，其对于休克机制方面的研究还不够深入，尤其缺乏关于机体本体差异和休克发生、发展之间联系的探讨和研究，亦没有真正发掘出与休克相关的关键性基因。相信随着基因芯片技术的不断成熟和进步，它一定会在休克机制的深入研究和新的治疗方法的探索中起到越来越重要的作用。

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