洱海下游肠道致病菌噬菌体分离与鉴定

李 洁，余泽英，赵宗美，颜怡君，马志刚，刘 奇

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

洱海下游肠道致病菌噬菌体分离与鉴定

李 洁，余泽英，赵宗美，颜怡君，马志刚，刘 奇*

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

目的：分离洱海下游水体中的肠道致病菌噬菌体，了解肠道致病菌污染情况。方法：通过噬菌斑法从洱海下游水体中分离和鉴定各种肠道致病菌噬菌体。结果：成功分离出了痢疾杆菌噬菌体、伤寒杆菌噬菌体、乙型副伤寒杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体4种肠道致病菌噬菌体。结论：洱海下游水体存在痢疾杆菌、伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌、大肠杆菌污染，提示需进一步加强大理周边生活污水排放的治理工作。

肠道致病菌;洱海；噬菌体

洱海是中国7大淡水湖之一，也是云南省第2大淡水湖〔1〕。20世纪70年代以来，洱海一直遭受着各种人为的污染，并呈现逐年恶化的趋势〔2〕。尽管近年来国家和当地政府投入了大量的人力、物力对洱海进行综合治理，并取得了显著成效，但目前对洱海肠道致病菌污染情况并不清楚。因此，本研究将通过对洱海下游（西洱河）肠道致病菌噬菌体的检测，了解洱海水质中肠道致病菌的存在情况，从公共卫生角度为洱海治理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料噬菌体分离所用的指示菌为伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌，菌种均由大理学院基础医学院病原生物学综合实验室提供。

1.2方法

1.2.1 采集地点 采集地点选择在洱海下游（西洱河）泰安桥水闸处进行采样检测，每次用无菌瓶采集水样500 mL。

1.2.2 噬菌体的分离 各标准菌株在普通琼脂培养基上激活2次。取肉汤培养基20 mL（含1 mmol/ L CaCl2），加入标准菌对数期菌悬液2 mL（0.5个麦氏单位）以备扩增噬菌体。取水样50 mL，0.22μm滤膜滤除水样中的细菌，并将滤液加入上述含标准菌悬液的培养基混合培养（37℃振荡培养24 h）扩增噬菌体。培养物12 000 r/min离心30 min，上清液即为噬菌体悬液，加入氯仿60μL备用。取0.1 mL上述噬菌体悬液、0.2 mL对数期标准菌悬液（0.5个麦氏单位）与3 mL 50℃的半固体普通琼脂培养基混合，并快速均匀的铺在已准备好的普通琼脂培养基上（双层琼脂法）。37℃培养过夜。次日观察是否有噬菌斑并记录结果，并进行单斑分离纯化〔3〕。

2 结果

如有噬菌体存在，可见平板上有噬菌斑形成。噬菌斑在双层琼脂平板为细小、形状不规则，透明状空斑。本研究在洱海水样中分离出了伤寒杆菌噬菌体、乙型副伤寒杆菌噬菌体、痢疾杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体。提示洱海下游水体中有相应病原体存在。

3 讨论

噬菌体（bacteriophage，phage）是一类感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物病毒的总称，在1896年-1898年，先后被英国 Hankin和俄国Gamaleya两位细菌学家发现并命名〔4〕。噬菌体在自然界分布极广，凡是有上述微生物的地方，都有相应的噬菌体存在〔5〕。噬菌体在数量上一般是细菌的10倍左右，被认为是地球上数量最多的病毒类型〔6〕。尽管噬菌体在环境中广泛存在，但噬菌体仅侵染某一个细菌菌种或侵染一个细菌菌种内的一或两个亚种噬菌体，由于这种严格的宿主特异性〔4〕，噬菌体已用于多种细菌感染性疾病的诊断和治疗〔7-10〕。

由于肠道致病菌较强的传染性，肠道致病菌引起的各种腹泻均为国家法定传染病〔11〕。常见肠道致病菌噬菌体已在医院、城市排污系统等水体中分离成功〔12〕，但在洱海中分离肠道致病菌噬菌体尚未见报道。由于洱海与周边及下游居民生活息息相关，其污染的危害远远超过其它水体。洱海是大理周边居民的母亲湖，与居民关系密切，如该水体被肠道致病菌污染，则可致洱海周边居民和家畜被感染或携带致病菌，甚至引发周边居民和旅游者肠道传染病的感染和流行。

因此，本研究分离洱海下游各种肠道致病菌噬菌体，以判断其遭受肠道致病菌污染的情况。实验在采集的水样中分离出大肠杆菌噬菌体、伤寒杆菌噬菌体、痢疾杆菌噬菌体、乙型副伤寒杆菌噬菌体共4种常见肠道致病菌噬菌体，表明该环境中存在相应肠道致病菌，提示洱海下游水体已遭受周边居民的污染，这与焦春香等〔13〕的结论相符。洱海水体中这些肠道致病菌的存在将对周边人畜饮水安全构成威胁，甚至存在小规模爆发相关疾病的可能性。鉴于以上结果，卫生环保部门应进一步加强城市污水的综合治理工作，同时医院及基层防疫机构也应该加强对城市居民，尤其是肠道传染病病人的健康教育，做好粪便的管理，防止对环境的污染。

〔1〕徐安伦，董保举，刘劲松，等.洱海湖滨大气边界层结构及特征分析〔J〕.高原气象，2010，29（3）：637-644.

〔2〕程艳，李柄花，此里能布，等.洱海弥苴河流域降雨侵蚀力特征研究〔J〕.中国水土保持，2008（6）：29-33.

〔3〕郭海萍，陈振辉，黄艳梅，等.污水中肠道杆菌噬菌体的分离及其生物学活性研究〔J〕.南方医科大学学报，2007，27（10）：1545-1546.

〔4〕王梅，海荣.鼠疫噬菌体研究概述〔J〕.中国媒介生物学及控制杂志，2011，22（3）：297-300.

〔5〕苏胜兵，马红霞，徐凤宇.噬菌体在细菌性疾病诊断和治疗中的应用〔J〕.中国兽医科学，2011，41（5）：546-550.

〔6〕Weinbauer M G.Ecology of prokaryotic viruses〔J〕.Fems Microbiology Reviews，2004，28（2）：127-181.

〔7〕Cairns B J，Timms A R，Jansen V A A，et al.Quantitative Models of In Vitro Bacteriophage-Host Dynamics and Their Application to Phage Therapy〔J〕.Plos Pathogens，2009，5（1）：1-10.

〔8〕刘晓彬，王珂，成伏波，等.噬菌体对小鼠肠源性铜绿假单胞菌感染的治疗作用〔J〕.吉林大学学报：医学版，2009，35（4）：660-663.

〔9〕温占波，李劲松.噬菌体治疗细菌性疾病的研究进展〔J〕.军事医学科学院院刊，2008，32（2）：172-174.

〔10〕成伏波，郑文旭，李菁华，等.噬菌体疗法对烧伤合并铜绿假单胞菌感染小鼠的治疗作用〔J〕.中国感染与化疗杂志，2009，9（1）：18-21.

〔11〕中华人民共和国传染病防治法〔S〕.

〔12〕徐焰，熊鸿燕，苏明权，等.医院内污水中噬菌体的及其生物学特性观察〔J〕.第四军医大学学报，2003，24（9）：846-848.

〔13〕焦春香，刘东平，陶景丽，等.大理洱海水体粪大肠菌群污染状况初步调查〔J〕.大理学院学报，2010，9（8）：29-30.

*通信作者：刘奇，讲师.

（责任编辑 董 杰）

Isolation and Identification of Bacteriophages Specific to Intestinal Pathogen in the Water of Downstream of Erhai Lake

LI Jie,YU Zeying,ZHAO Zongmei,YAN Yijun,MA Zhigang,LIU Qi*
（School of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the distribution of intestinal bacteria in the downstream of Erhai Lake by isolation and identification phage of intestinal bacteria.Methods:Plaque method was applied to isolate and identify bacteriophages specific to intestinal pathogens in the water of Erhai Lake.Results:Bacteriophages specific to dysentery bacillus,typhoid bacillus,paratyphoid B bacteria,E.coli were successfully isolated.Conclusion:The downstream water of Erhai Lake was contaminated by dysentery bacillus, typhoid bacillus,paratyphoid B bacteria and E.coli.This suggested that it is necessary to further strengthen the management of surrounding living sewage discharge in Dali City.

intestinal pathogen;Erhai Lake;phage

R372

A

1672-2345（2011）12-0097-02

大理学院大学生科研基金资助项目（KYSX2010-051）

2011-10-12

李洁，2007级医学检验专业本科学生.