原生质体技术在蔬菜育种中的应用进展

孙 贺，刘乐承 （长江大学园艺园林学院，湖北 荆州434025）

原生质体是除去细胞壁后得到的微球体［1］。原生质体技术是指在原生质体分离基础上进行的一系列技术操作，主要包括原生质体融合、遗传转化、植株再生等［2］。自从1960年Cocking首次用纤维素酶制备番茄根原生质体获得成功，迄今已有46个科160多个属360多种植物的原生质体再生植株问世，80多种科间、属间、种间或品种间细胞融合获得胞质种［3-5］。近年来，人们将原生质体技术广泛应用于蔬菜育种工作中，并取得了令人瞩目的成果，获得了甘蓝和白菜［6］、蕃茄［7-8］、油菜［9］、萝卜［10］等体细胞杂交植株。

1 原生质体植株再生技术及变异

1．1 原生质体植株再生途径

原生质体再生植株的形成有以下途径［4，11］：细胞团发育形成愈伤组织，经分化形成植株；愈伤组织分化形成胚状体，再发育成植株；直接形成胚状体，再发育成植株。

1．2 原生质体再生植株变异

黄瓜的再生植株多为四倍体或者是多倍体，形态表现为株型矮小，节间粗短，叶片深绿、小而厚硬，早花早果［12］。李耿光等［13］发现马铃薯的再生植株叶片出现了披针形、匙形和肿胀现象，叶片表现不一致，茎杆粗细不均。大白菜的再生植株可以得到二倍体［14］。但是，叶肉原生质体再生植株具有正常四倍体的频率很低，而非整倍体频率很高，染色体变异明显。而熊新生［15］发现在甘蓝原生质体再生的无性系中也有高频率的染色体倍性的变异。

1．3 原生质体再生植株变异的原因

再生植株的变异受实验过程中外界条件的影响比较大。首先，原生质体的来源多种多样，变异类型也因植物种类、品种而异。同时分离原生质体的植物材料本身对变异的影响也很大，使用无性繁殖的植物更易发生变异。对于甘蓝，主要是从子叶、根、叶片、下胚轴等分离出原生质体［16］。其次，同一种类的植株采用的原生质体来源不同，再生植株的变异也各不相同。再次，各个培养条件是经过研究探索发现的，这种人工创造的条件无法与真正的细胞环境条件相比。而外源激素对原生质体培养的影响也比较显著，其他影响因素也不容忽略。

2 原生质体融合和细胞杂交技术在蔬菜育种中的应用

原生质体融合就是2种异源原生质体，在诱导剂的诱发下相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合，再经过细胞壁再生形成杂种细胞的过程［17］。细胞杂交包括体细胞杂交、不对称细胞杂交、体细胞和性细胞杂交和微细胞杂交。不对称细胞杂交产生具有1个亲本的细胞核和2个亲本的细胞质的体细胞杂种［4］，可以克服有性杂交不亲和以及增加育种工作中变异［18］。

2．1 获取并转移外源遗传物质，进行遗传转化

原生质体是进行非载体遗传操作的良好受体，可以直接摄取外源物质，包括细胞核、细胞器基因组、DNA片断及病毒颗粒，直接进行基因转化，是进行遗传转化研究的理想工具。Mukhopadhyay等［19］报道，甘蓝下胚轴原生质体在PEG的介导下，直接摄取抗潮霉素的标记基因的质粒DNA，转化频率10%～30%，而且获得了转化再生植株。由此可见，细胞质融合技术明显优于有性杂交是因为可以对细胞质进行遗传操作，从而引起各种细胞器的重组。体细胞杂交创造变异的潜力很大，能够丰富种质资源，保持和促进生物多样性。

2．2 原生质体融合获得胞质杂种

胞质杂种可以通过以下3种途径产生：1个正常的原生质体与1个去核的原生质体融合；1个正常的原生质体与1个核失活的原生质体融合；融合以后的某一阶段1个亲本的核或者染色体被排除［4］。

体细胞杂种综合了双亲的全部性状，双亲所有的遗传物质都会影响杂种后代的表现，所以对体细胞杂交后代的改良也是一个艰巨的工程，而胞质杂种有望减轻这一工程的工作量，可能会解决对称融合倍性增加和优劣性状均进入杂种的问题［20］。另外，非对称杂交时，受体亲本多倍化可以缓冲外来基因组产生的某些负效应［21］；进行对称杂交时，亲本的倍性高可能会造成基因组间不协调、重组复杂等，给选择有用杂种后代增加难度，因此对称体细胞杂交常与花药培养相结合，来进行优良基因的组合［22］。若对野生亲本先进行花药培养再进行体细胞杂交，会使体细胞杂种在形态上更接近栽培亲本，有利于得到利用价值高的体细胞杂种［23］。

2．3 实现远源遗传重组，创造新的育种材料，培育新品种

原生质体融合在一定程度上克服杂交育种中诸如不亲和性、性器官败育障碍等，获得杂种，但亲缘关系越远，获得遗传上稳定的杂种难度越大［24］。在甘蓝育种中，种间的和属间的杂种为甘蓝品种改良提供了丰富的变异类型［25］。Schenck等［26］首次获得了甘蓝与白菜的体细胞杂种。白菜型油菜与甘蓝进行体细胞杂交得到了合成种［4］。番茄与类番茄进行种间杂交得了体细胞杂种［27］。Horita等［28］得到了百合属体细胞杂交的后代。通过体细胞杂交也可以提高植株的抗逆性。李省印等［29］新育出的 “优生1号”平菇品系，经栽培试验发现其适应性强、优质、丰产、抗杂、耐热。一些野生种中，有许多抗虫、抗病、抗旱、耐盐碱、抗高温等优良性状，将栽培植物与野生种作为亲本，经过原生质体融合、选择与再生，从而获得野生种的抗逆特性。

3 存在问题与展望

原生质体技术本身也还存在一些问题，首先原生质体植株再生的难易会直接影响体细胞杂交育种的成败。其次，诱导融合过程中的许多因素会直接影响到原生质体的活力、融合率，使得诱导物质的使用、融合方法的选择显得很重要，所以应进一步进行提高融合频率的研究，尤其是电融合技术在原生质体融合中的应用研究更要加强［30］。再次，体细胞杂种或胞质杂种本身染色体数目不确定，而且染色体结构易发生变异，以及存在异常的减数分裂等，造成培养过程中出现不稳定的问题。此外，体细胞杂交育种同样存在杂种不育或育性差的问题。

当某一性状的遗传基础不明确或存在多基因或胞质基因控制的情况下，进行有关基因的转移是目前利用基因工程手段还无法实现的，而体细胞杂交则能实现这类基因的转移［31］。原生质体技术的应用不仅仅培育了一批优良品种，更催生了一大批先进实用的研究成果和技术。在大力推广常规脱毒和快繁技术的同时，加快发展植物快繁生物反应器，将为种苗业带来新的变革。应用植物细胞培养技术生产植物来源的生物产品，尽管目前仅在少数植物上实现了商业化生产，但随着植物细胞工程生物反应器技术的完善，其应用领域将进一步扩大。

原生质体技术在种质创新和品质改良上显示了巨大潜力，并不意味着它可以完全取代常规育种技术。正如社会发展到今天，纸张依然无法取代一样。所以原生质体培养和体细胞杂交技术与遗传转化技术相辅相成，与常规育种技术结合起来，将为植物基因组之间的结合和相互作用以及新品种的培育提供无限的可能性［11］。

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