超高静压对细菌芽孢致死效应的研究进展

王标诗，杜建中，金 蓓，李汴生，曾庆孝，阮 征，黄海敏

超高静压对细菌芽孢致死效应的研究进展

王标诗1，杜建中1，金 蓓1，李汴生2，曾庆孝2，阮 征2，黄海敏1

(1.湛江师范学院化学科学与技术学院，广东 湛江 524048；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

在超高静压杀菌过程中，细菌芽孢往往比其营养体更耐压，而单独的压力处理并不能完全杀死芽孢。超高静压对普通微生物营养体有较好的杀灭效果，但超高静压对细菌芽孢杀灭效应有待于进一步研究。研究表明，超高静压结合适度的热处理能显著增加芽孢的杀灭效果。本文综述了芽孢对食品安全的影响、超高静压诱导芽孢发芽以及超高静压导致细菌芽孢失活的影响因素等。

超高静压；灭活；细菌芽孢

超高静压对普通微生物营养体有较好的杀灭效果，但人们对有关超高静压对细菌芽孢杀灭效应的认识还很有限。一般来说，处于对数生长期的细胞比处于静止期的细胞对压力反应更为敏感。革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对压力更具抵抗力，芽孢对压力的抵抗力更强，可以在高达1000MPa的压力下生存，病毒对压力也有较强的抵抗力[1]。芽孢菌是食品是否彻底杀菌的标志，而杀死芽孢也是食品加工和贮藏中最难解决的问题之一。

1 食品安全与芽孢

细菌芽孢对物理和化学处理极端的抗性使得它们成为食品工业非常关注的问题。为了确保食品安全，需要使用高强度的处理方法，但这会损害食品的质量。在食品中发现芽孢能引起感官质量的破坏，典型的是芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属[2]。与人类健康密切相关的是能引起食源性疾病的芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属，从引起呕吐性的疾病到威胁生命的波特淋菌中毒都包括在内。最重要的能形成芽孢的食源性病菌是：1)肉毒梭状杆菌(Clostridium botulinum)。它能产生一种对人类最致命的毒素，也是产生具有潜在致命性疾病食源性波特淋菌中毒的一个原因，这种中毒非常少见[3]。波特淋菌中毒是由细菌产生的神经毒素的摄取引起的，这种细菌最常出现在家庭装罐藏食品中，中毒后最典型的特征就是肌肉麻痹，可能导致窒息[4]。2)产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。它也能引起食源性疾病，最典型的症状为腹痛，腹泻和呕吐，它经常出现在加工好的肉制品中[5]。3)蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。蜡状芽孢杆菌在很多食品中食源性疾病发生时普遍存在的一种微生物，特别是在那些与土壤有关的食品[6]。由蜡状芽孢杆菌引起的食源性疾病的发生很难准确预测，因为此疾病发病症状不明显，并不值得报告[7]。地衣杆菌和枯草杆菌也常与食源性疾病的爆发有关[2,8]。能引起食源性疾病且可形成芽孢的一些细菌见表1。

表1 细菌芽孢导致的食品腐败Table 1 Food spoilage caused by spore-forming bacteria

2 压力诱导芽孢萌发

休眠的芽孢对热、辐射和有毒的化学物质有极端的抗性，而萌发的芽孢就失去了这些极端的抗性。这也是高压处理能杀死芽孢的主要原因，因为高压处理能使芽孢萌发。发芽的芽孢会被压力和由压力导致的高温所杀死，然而，这些处理温度不能完全杀死休眠的芽孢。

压力诱导芽孢萌发的机理因所使用的压力而有所不同。50～300MPa的中等高压是通过激活芽孢的营养受体，并由激发的营养发芽通道来诱导萌发的[14-16]。相反，400～800MPa特别高的压力并不是通过营养受体而诱导发芽的[14-15,17]。确切地说，特别高的压力直接引起钙吡啶2,6-二羧酸复合物(Ca-DPA)的释放，从而引发芽孢的发芽。对于这两种压力的任一种而言，发芽的芽孢继续通过萌发的第二阶段，然而，如果高压处理条件阻止或抑制了皮层溶解酶的作用，孢子则只能迅速完成萌发的第一阶段，如果可能的话再慢慢的通过第二阶段[17]。第一阶段萌发的芽孢和二阶段萌发的芽孢对湿热的敏感性不同，它们比休眠的芽孢更敏感。特别高的压力处理可以使芽孢完全发芽，但是生长很缓慢[18]。

总的来说，最近几年有关压力诱导芽孢发芽的研究很多，但是对这一过程仍有很多不明确的问题。其中一个是仍有小部分超休眠芽孢受各种发芽条件(包括压力)诱导发芽的速率相当慢。因此，这些超休眠的芽孢在某些处理条件下(如高压)仍能存活，只有让这些芽孢发芽才能杀死它们。在高压处理中这些超休眠的芽孢的灭活成为一个难点，主要是因为不清楚导致芽孢超休眠的原因。因此，芽孢超休眠现象是值得进一步研究的芽孢生物学问题，因为如果超休眠的芽孢有时不能完全失活，这将是超高静压处理在食品工业应用中潜在的重要难题。

3 超高静压下细菌芽孢失活的影响因素

细胞本身的遗传性、组成、形态、种类，处理温度、环境介质、pH值等，其他的协同条件(如添加防腐剂、与超声波组合等)等都是芽孢失活的影响因素。

3.1 细胞本身的影响

不同的芽孢菌由于其组成不同，其对超高静压的耐压性不同。有研究者报告[19-20]，芽孢菌对压力的抗性为：嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)＞凝结芽孢杆菌(B.coagulans)＞黏草芽孢杆菌(B.subtilis)＞蜡状芽孢杆菌(B. cereus)＞多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)＞巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。施加压力下，芽孢较大的菌类(如蜡状芽孢杆菌)比芽孢较小的菌类(如枯草芽孢杆菌)更为敏感；杆状、薄片状比球状也更为敏感。

3.2 pH值的影响

酸性条件通常能增强高压灭活细菌微生物的效果[21]。在低pH值下压力对芽孢灭活的影响有两种观点，一种认为增强，一种则认为有一点效果甚至没效果。Roberts等[22]发现凝结芽孢杆菌在pH4.0时比在pH7.0时对压力(400MPa)灭活更有效。对于在100～600MPa和40℃处理的枯草芽孢杆菌来说，Wuytack等[23]发现酸性环境并不能增加芽孢的灭活效果，然而，当芽孢先在中性pH值高压处理再经过1h的低pH值环境其灭活效果更高。王琴等[24]研究表明，不同pH值(3.6～6.6)对嗜热脂肪芽孢杆菌的灭活效果不明显。

3.3 介质成分的影响

芽孢所处的介质对其发芽有很大的影响，因为很多食品有很丰富的芽孢发芽所需营养物。此外，一些食品如牛奶，对营养细胞有一定的保护作用[25]。Moerman等[26]研究表明脂肪含量高的肉和碳水化合物含量高的土豆介质同有机成分少的介质相比它们能赋予梭状芽孢特别强的保护作用。Reddy等[27]比较肉毒杆菌在缓冲液和蟹肉中高压灭活效果，结果发现，蟹肉对致死效果并不起保护作用，然而van Opstal等[28]发现蜡状芽孢在牛奶中比在缓冲液中发芽水平更高，而在牛奶中蜡状芽孢的存活率比在缓冲液中要高1个数量级，这表明尽管在牛奶中更易发芽，但是牛奶中的成分能保护细胞，降低压力对其致死效果。

3.4 热处理组合方法的影响

在室温条件下，单独依靠超高静压很难得到理想的芽孢灭活效果。因此，仅仅只依靠超高静压的手段想达到芽孢失活的效果并不理想，而且要达到更高的压力需要更好的仪器设备等，研究表明热处理同超高静压的组合能显著提高细菌芽孢的灭活效果。Stewart等[29]研究表明，柠檬酸盐缓冲液中枯草芽孢杆菌孢子数在高温条件下比在室温条件下降低更多，404MPa和70℃能使孢子下降5个数量级，而在同样的压力和室温条件下只能降低0.5个数量级。Millls等[30]也报道了生孢梭菌孢子在600MPa和20℃处理30min只有很小甚至没有钝化效果，而400MPa和60℃同时处理30min或80℃室温下先处理10min，接着400MPa、40或60℃再处理30min更有效，可使其下降3个数量级。Rajan等[31]研究蛋饼(低酸性食品)中的嗜热芽孢杆菌在压力和热处理下失活的情况，相对于常见热杀菌条件(121℃)下，15min嗜热芽孢杆菌芽孢减少1.5个数量级；在700MPa、105℃、5min条件下则减少了4个数量级。

曾庆孝[32]对超高静压下嗜热脂肪芽孢杆菌杀菌作用的研究结果表明，压力处理前经预热处理(45℃、20min)比压力处理后再经热处理有更高的杀菌作用。高瑀珑等[33]通过响应面对杀灭芽孢杆菌的分析实验来研究温度(30～60℃)、压力(200～600MPa)和处理时间(10～20min)对灭活枯草芽孢杆菌杀灭的影响，这些因素影响的顺序为：温度＞压力＞压力处理时间。

在高压组合热处理加工中压力辅助热杀菌是当前研究的热点问题[34-35]。压力辅助热杀菌是压力和温度的组合过程，以此来使芽孢失活。单独的压力对细菌的营养体有显著的效果，而单独的压力对细菌芽孢的作用很有限。当然，芽孢是食品工业很关心的问题，特指杆菌属和梭状杆菌属，尤其是肉毒杆菌。在货架温度的低酸性食品的制造过程中，微生物安全是必须要特别考虑的重要先决条件，肉毒杆菌芽孢的消除是最关键的目标。压力辅助热处理对孢子的致死可以看成是压力下蛋白质的聚集和热处理下蛋白质变性和酶失活的组合[36]。当然，这种双重过程的应用不能看成是非热过程，但是压力下热处理的温度相对来说较低的。压力辅助热杀菌能有效地去除微生物的存在，包括营养体和芽孢，而获得的产品的质量优于传统的热杀菌方法[37]。

3.5 其他组合方法的影响

Hayakawa等[38]在富含营养成分介质中的脂肪嗜热芽孢杆菌芽孢进行了超高静压杀菌研究。经过600MPa、70℃(指加压过程中测出的实际温度，包括加压前加热和绝热压缩温升)，加压5min，然后降至常压，并重复脉冲加压处理5次。超高静压处理后，立即用营养琼脂平板在55℃经过7d培养未能检出微生物，起到了完全杀灭作用。而在70℃以下进行同样压力和更长保压时间的超高静压处理，也不能达到完全灭菌的效果。Furukawa等[39]比较了连续和循环压力处理对枯草芽孢杆菌芽孢钝化效果，循环压力处理下其钝化和损伤效果都比连续压力处理时的情况好，对于孢子结构的破坏，如包衣和皮层，通过扫描和透射电镜观察在循环压力下更明显。

Garcia-Gonzalez等[40-41]报道了对悬浮在生理盐水中的枯草芽孢杆菌芽孢，在温度为36～75℃、压力为7～15MPa、保压时间1～24h的条件下进行杀菌处理。单独进行60℃、24h加热处理枯草芽孢杆菌芽孢，芽孢无一灭活；但是在60℃、7MPa、保压24h超临界CO2处理，所有芽孢全部灭活。单独进行75℃、24h加热处理只有部分芽孢灭活；而在75℃、7MPa、保压2h超临界CO2处理，所有芽孢全部灭活。

多种抗菌物同高压组合来增强细菌芽孢压力灭活效果。这些抗菌物的使用可以降低压力处理条件，因此，更能保持食品的营养和感官特性。尼生素也常被用于高酸性和低酸性食品中抑制细菌的生长和破坏，如嗜热脂肪芽孢杆菌。

高压和辐射的组合能增强生孢梭菌芽孢的灭活效果。Crawford等[42]发现先进行中等辐射在压力处理同单独压力处理相比能提高钝化效果。压力和辐射同时处理也都能提高芽孢的钝化效果[43]。

高压和脉冲电场组合作为一种食品处理方法对孢子灭活不能保证一定有效，仍值得进行探讨。Pagan等[44]试图通过高压诱导杆状芽孢发芽再进行脉冲电场处理钝化敏感的发芽细胞。然而，对孢子灭活的研究结果表明效果不好，没有进一步研究的必要。

4 结 语

在超高静压杀菌中，细菌芽孢比营养体更耐压，而且单独的压力处理并不能充分达到杀灭芽孢的效果。最近很多研究表明，超高静压协同中温能够有效地增加芽孢的灭活效果。压力辅助热杀菌有望解决细菌芽孢难杀灭的问题，但是有关这方面的报道相对较少，其致死芽孢的机理有待于进一步的研究。

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Progress of Research on Inactivation Effect of High Hydrostatic Pressure Processing on Bacterial Spores

WANG Biao-shi1，DU Jian-zhong1，JIN Bei1，LI Bian-sheng2，ZENG Qing-xiao2， RUAN Zheng2，HUANG Hai-min1
(1. School of Chemistry Science and Technology, Zhanjiang Normal College, Zhanjiang 524048, China；2. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

In high hydrostatic pressure treatment, bacterial spores are more resistant than vegetative cells thus pressure treatment alone is not sufficient in inactivating bacterial spores. High hydrostatic pressure processing can effectively inactivate vegetative bacteria; however, the knowledge about inactivation on bacterial spores by the high hydrostatic pressure is still limited. Recently, many researchers demonstrated that the combination of high hydrostatic pressure with moderate heat treatment were effective in increasing the inactivation of bacterial spores. This review focuses on food safety and spores, high hydrostatic pressure-induced germination and effects of high hydrostatic pressure on inactivation of bacterial spores.

high hydrostatic pressure；inactivation；bacterial spores

TS201.2

A

1002-6630(2011)03-0252-04

2009-12-15

广东省自然科学基金项目(05006597)；湛江师范学院博士启动项目(ZL0805)；

广东省高校优秀青年创新人才培养计划项目(LYM09100)

王标诗(1980—)，男，讲师，博士，研究方向为食品工程及安全。E-mail：hang_kong2002@163.com