长双歧杆菌BBMN68对便秘模型小鼠的通便作用

丁 圣，蒋菁莉，刘松玲，刘爱萍，任发政,*

长双歧杆菌BBMN68对便秘模型小鼠的通便作用

丁 圣1，蒋菁莉1，刘松玲2，刘爱萍1，任发政2,*

(1.蒙牛乳业(北京)有限责任公司，北京 101107；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

目的：研究长双歧杆菌活菌BBMN68活菌液对便秘模型小鼠的润肠通便作用。方法：将Balb/c雄性小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组和3个剂量的给药组。给药组分别经口给予低、中、高剂量(1×107、1× 108、1×109CFU/mL)的长双歧杆菌BBMB68活菌液0.1mL/(kg·d)(以体质量计)；空白组和模型组给予0.1 mL/(kg·d)的质量分数10%的脱脂奶溶液；阳性对照组给予1×108CFU/mL动物双歧杆菌菌悬液0.1mL/(kg·d)。用复方地芬诺酯制造小鼠便秘模型，建模后各组分别给药，观察各组小鼠的首次排黑便时间、5h内排便粒数和质量，测定粪便含水量和小肠墨汁推进率。结果：长双歧杆菌BBMN68给药7d，可明显改善便秘小鼠首次排黑便时间、增加排黑便粒数和质量；长双歧杆菌BBMN68给药15d可显著提高便秘小鼠小肠墨汁推进率。表明长双歧杆菌BBMN68具有润肠通便功能。

双歧杆菌；通便；小鼠；便秘

根据FAO/WHO(2002)的定义，益生菌是指由单一或多种微生物组成的活菌，当摄入一定剂量时，能通过改善宿主肠道微生态平衡来促进人体健康[1]。作为一个有效的益生菌菌种，具有以下特点：来源安全、无致病性、能够耐受胃酸和胆汁、能黏附于肠黏膜而阻止病原微生物的黏附、有益于人体免疫及其他临床证实的各种保健功能[2]。目前用于食品的益生菌主要有乳酸菌和双歧杆菌，调节肠道菌平衡是益生菌最直接和最根本的一项功能，本实验通过便秘小鼠模型研究来源健康人群肠道的长双歧杆菌BBMN68菌株的润肠通便功能。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

Balb/c 雄性小鼠，6～8 周龄，体质量18～22g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

长双歧杆菌BBMN68菌株分离至长寿老人粪便(CGMCC.2265)，用MRS液体培养基37℃厌氧培养18h，4000r/min离心10min，菌体沉淀重悬于质量分数10%脱脂乳中，配制不同浓度菌悬液。阳性对照菌株为分离自市售保健酸奶的双歧杆菌，经16S rDNA序列测定鉴定为动物双歧杆菌，菌株活化及制备方法同长双歧杆菌BBMN68。

复方地芬诺酯片(批号0811081) 江苏平光制药有限公司；活性炭粉 巩义市嵩山滤材活性碳厂；阿拉伯树胶 广东汕头市西陇化工厂；MRS培养基 北京奥博星生物技术有限公司。

SW-CJ医用型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；XSZ-G生物显微镜 重庆光学仪器厂；ZDX35BI高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DNP9082恒温培养箱、DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；3K30 型低温高速离心机、ACCULAB分析天平 德国Satorious公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

墨汁的配制：准确称取阿拉伯树胶100 g，加水800mL，煮沸至溶液透明，称取活性碳(粉状)50g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液凉后加水定容到1000mL，于冰箱中4℃保存，用前摇匀。

复方地芬诺酯混悬液(0.05g/100mL)的配制：复方地芬诺酯片，每片含复方地芬诺酯2.5mg，取20片用研钵研碎呈粉末后加水至100mL，临用前配制。

1.2.2 实验动物分组及处理

实验设3个剂量组，空白对照组、阳性对照组和模型对照组。空白组和模型组小鼠灌胃质量分数10%脱脂乳0.1mL/(kg·d)(以体质量计)；低剂量、中剂量、高剂量组小鼠分别灌胃1×107、1×108、1×109CFU/mL的BBMN68菌悬液0.1mL/(kg·d)(以体质量计)，阳性对照组小鼠灌胃1×108CFU/mL动物双歧杆菌菌悬液0.1mL/(kg·d)(以体质量计)。每天一次，实验期间自由进食，记录各组小鼠体质量变化。

1.2.3 小鼠排便实验[3]

给受试样品7d后，各组小鼠禁食不禁水16h。模型对照组、阳性对照组和3个剂量组小鼠灌胃给予复方地芬诺酯(10mg/kg)，空白对照组给予蒸馏水。2×107、2×108、2×109CFU/mL 的BBMN68菌悬液及2× 108CFU/mL动物双歧杆菌菌悬液与墨汁等体积混合，给予复方地芬诺酯0.5h后，空白对照组和模型对照组小鼠灌胃墨汁0.1mL/kg(以体质量计)，低、中、高剂量组及阳性对照组给予含受试样品的墨汁0.1mL/kg(以体质量计)，动物均单笼饲养，正常饮水进食。从灌墨汁开始，记录每只动物首粒排黑便时间、5h内排黑便粒数、质量。收集的粪便在105℃烘干至质量恒定，测定粪便含水率。

1.2.4 小肠推进实验[3]

给受试样品15d后，各组小鼠禁食不禁水16h。模型对照组、阳性对照组和3个剂量组小鼠灌胃给予复方地芬诺酯(5mg/kg)，空白对照组给蒸馏水。给复方地芬诺酯0.5h后，低、中、高剂量组和阳性对照组分别给予含受试样品的墨汁0.1mL/kg(以体质量计)(样品剂量同1.2.3节小鼠排便实验)，其他对照组灌胃墨汁0.1mL/kg (以体质量计)。25min后立即脱颈椎处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按式(2)计算墨汁推进率。

1.3 数据处理

方差分析，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，各组均数间有显著差异；用多个实验组和一个对照组间进行t检验。

2 结果与分析

2.1 小鼠体质量变化

表1 实验小鼠体质量变化(x±s，n=10)Table 1 Body weight of mice during the experiment (x±s，n=10) g

由表1可知，实验期间，小鼠的体质量在各剂量实验组与各组对照组间比较，均无显著性差异(P＞0.0 5)，在实验期间，阳性对照菌株和长双歧杆菌BBMN68菌株对雄性小鼠的体质量无影响。

表3 双歧杆菌BBMN68对小鼠墨汁推进率的影响n=10)Table 3 Effects of Bifidobacterium strain BBMN68 on the ink propelling rates in mice (n=10)

表3 双歧杆菌BBMN68对小鼠墨汁推进率的影响n=10)Table 3 Effects of Bifidobacterium strain BBMN68 on the ink propelling rates in mice (n=10)

组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组墨汁推进率/%69.27±6.7747.08±12.42▲▲63.08±10.21**59.25±10.21*68.81±11.45**58.61±13.50*

2.2 长双歧杆菌对小鼠排便的影响

实验小鼠经口灌胃长双歧杆菌BBMN68菌株，7d后测定对便秘模型小鼠首粒排便时间、5h内颗粒、质量及粪便含水率的影响，结果见表2。与空白对照组比较，模型组小鼠首次排黑便时间、5h内排便颗粒和排便质量均有显著性差异(P＜0.01)，说明便秘小鼠模型成立。长双歧杆菌BBMN68给药7d，各剂量组小鼠粪便颗粒数均显著高于模型组(P＜0.05)，中剂量组效果最明显，达到极显著水平(P＜0.01)。双歧杆菌BBMN68中、高剂量组小鼠粪便质量显著高于模型组(P＜0.05)，中剂量组首次排黑便需要的时间明显低于模型组(P＜0.01)。与阳性对照组比较，长双歧杆菌BBMN68各剂量组小鼠粪便质量、粪便颗粒和粪便含水量无显著差异(P＞0.05)，长双歧杆菌BBMN68中剂量组首次排黑便时间数值明显比阳性对照组低(P＜0.05)。

表2 长双歧杆菌BBMN68对便秘小鼠各排便指标的影响(n=10)Table 2 Effects of Bifidobacterium strain BBMN68 on defecation index(，n=10)

表2 长双歧杆菌BBMN68对便秘小鼠各排便指标的影响(n=10)Table 2 Effects of Bifidobacterium strain BBMN68 on defecation index(，n=10)

注：▲▲.与空白对照组相比，有极显著性差异(P＜0.01)；*.与模型组相比，有显著性差异(P＜0.05)；**.与模型组相比，有极显著性差异(P＜0.01)；■.与阳性对照相比，有显著性差异(P＜0.05)。下同。

组别粪便质量/g首次排黑便时间/min粪便颗粒粪便含水量/%空白组0.949±0.195105.1±24.341.3±966.9±2.7模型组0.637±0.085▲▲153.7±20.0▲▲29.3±4.8▲▲64.1±3.6低剂量组0.730±0.226134.1±31.134±7.8*63.8±3.2中剂量组0.916±0.291*102.3±22.5**■40.8±7.4**67.1±2.7*高剂量组0.820±0.223*132.7±32.135.9±9.2*65.4±3.5阳性对照组0.846±0.171**126.0±9.0**35.9±7.8*68.2±3.2

2.3 小肠推进实验研究结果

小肠运动有3种方式，即张力收缩、分节运动和蠕动，主要以蠕动力推动肠内容物运动为主要方式。本实验经口灌胃给予实验小鼠造模药物复方地芬诺酯，建立小鼠小肠蠕动抑制模型，通过墨汁标记观察双歧杆菌活菌体对便秘小鼠肠道蠕动的影响。实验小鼠给药长双歧杆菌BBMN68活菌液15d，做小肠推进实验，各组小鼠肠道的墨汁推进率见表3。

由表3可知，模型组墨汁推进率显著低于空白对照组(P＜0.01)，小鼠便秘模型成立。长双歧杆菌BBMN68组给药15d，各剂量组小鼠墨汁推进率均显著高于模型组，其中低、高剂量组达到极显著水平(P＜0.01)，与空白对照组接近。长双歧杆菌BBMN68组小鼠与阳性对照组比较无显著差异(P＞0.05)。

3 讨 论

肠道内微生物在胃肠黏膜细胞提供营养中扮演着重要角色。肠道菌群处于微生态平衡时，肠道中有益菌占优势种群数量，益生菌具有调节肠道菌群平衡，调节机体免疫功能，增强消化、促进营养物质吸收等生理功效[4]，其中润肠通便、改善肠道菌群是益生菌最直接和最根本的一项功能。叶虹等[5]研究益生菌制剂对实验动物的改善胃肠道功能，益生菌制剂具有改善肠道菌群作用，有对抗复方地芬诺酯抑制肠推进作用及其所致的便秘作用。姜淑青等[6]的研究表明功效成分为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌的酸奶对人体具有明显通便功能。Yang等[7]研究了含有双歧杆菌发酵酸奶对便秘妇女的润肠通便功能，便秘人群使用含双歧杆菌B.lactis DN-173010菌株的酸奶1～2 周，便秘症状有所改善。酸奶中含有大量的益生菌，益生菌在体内可及时改善肠道菌群失调，增强人体免疫力，促进肠道菌群的活动。

便秘是一种常见的胃肠功能失调症，是许多慢性病的诱因，研究认为增加膳食中的膳食纤维和益生菌可有效地减缓便秘症状，益生菌的通便功能与菌株及便秘人群相关[8]。益生菌的生理功能具有菌株特异性，即不同的菌株、菌种和菌属具有不同的功能。文献报道不同菌株发酵乳对人群便秘和腹泻症状的改善作用，不同来源的植物乳杆菌改善症状效果不同[9]。本实验研究长双歧杆菌BBMN68 菌株对便秘模型小鼠的润肠通便功能，采用止泻剂复方地芬诺酯灌胃建立了小鼠慢性便秘模型，复方地芬诺酯主要是直接作用于肠道平滑肌，通过抑制肠黏膜感受器，消除局部肠黏膜的蠕动反射而使肠道蠕动减慢，使肠内容物通过延迟，致使小鼠排便减少或难排便，与便秘临床症状及诊断对比相同[10]。本实验中小鼠的便秘模型造模成功，通过实验从小鼠的首次排便时间、排便粒数和质量、粪便水分含量和墨汁推进率等指标评价双歧杆菌对便秘模型小鼠的通便功能。在本实验中，长双歧杆菌BBMN68给药7d，可明显改善便秘小鼠首次排黑便时间、增加排黑便粒数和质量；长双歧杆菌BBMN68组给药15d可显著提高便秘小鼠小肠墨汁推进率。表明长双歧杆菌BBMN68菌株具有润肠通便功能。从微生态学观点认为，当肠道内有足够的益生菌时，益生菌的代谢产物主要为L(+) -乳酸、乙酸和极少量甲酸、丙酸等有机酸类物质，这些物质对人体的肠壁神经有良好的刺激作用，可促进肠管蠕动及增加肠管内渗透压，使水分分泌亢进，从而产生通便功效，起到润肠通便功能[11]。长双歧杆菌BBMN68菌株对改善便秘小鼠胃肠功能的机理还有待继续研究。

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[4]宋士良. 益生菌在食品中应用状况及安全性评估[J]. 食品科技, 2009, 34(7): 22-26.

[5]叶虹, 杨隽, 叶于薇, 等. 益生菌制剂改善胃肠道功能的动物实验研究[J].中国微生态学杂志, 2001, 13(1): 19-21.

[6]姜淑青, 王晓军, 王玉祥, 等. 酸奶对人体润肠通便功能的影响研究[J]. 现代预防医学, 2009, 36(13): 2440-2441.

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Effect of Biofidobactria Strain on Defecating Function in Constipation Mice

DING Sheng1，JIANG Jing-li1，LIU Song-ling2，LIU Ai-ping1，REN Fa-zheng2,*
(1. MengNiu Dairy (Beijing) Company, Beijing 101107, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The objective of this study was to evaluate the defecating function of Biofidobacterium animal BBMN68 on constipated mice. Male Balb/c mice were randomly divided into control group, model control group, positive control group and 3 dosages groups. Mice of 3 dosages groups were orally administered with different concentrations of live B. BBMN68 (1 × 107, 1 × 108, 1 × 109CFU/mL) at 0.1 mL/(kg·d) dose once a day, and mice of control group as well as model control group were administered with 10% skim milk liquid 0.1mL/(kg·d), while the mice of positive control group with 1 × 108CFU/mL B. animal at 0.1 mL/(kg·d). Mice constipation model was established by using compound diphenoxylate. Each group was respectively treated with corresponding drugs, and then the time of defecation of the first black feces, the character of feces within 5 hours, and the promoting rate of ink were measured. Results: the mice administrated with B. BBMN68 for 7 days had the shorter time of defecation of the first black feces, and the number and weight of mice feces within 5 hours were increased; when the mice were administered with BBMN68 stain for 15 days, the ink propelling rates were increased. Conclusion: B. animal strain BBMN68 strain has the potential defecation function in constipation mice.

bifidobacteria；defecation；mice；constipation

R37； TS201.3

A

1002-6630(2011)03-0195-04

2010-06-01

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD04A06)

丁圣(1968—)，男，高级工程师，主要从事乳品加工研究。E-mail：mndingsheng@126.com

*通信作者，任发政(1962—)，男，教授，博士，主要从事功能性乳品研究。E-mail：renfazheng@263.net