脉冲电场对荔枝汁中酿酒酵母的杀灭效果

刘新雨，曾新安，贾 晓

脉冲电场对荔枝汁中酿酒酵母的杀灭效果

刘新雨，曾新安*，贾 晓

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

研究不同电场强度和处理时间的脉冲电场(PEF)对荔枝汁中酿酒酵母菌的杀灭效果，并探讨能量输入对酿酒酵母杀灭效果的影响。结果显示：电场强度的增大和处理时间的延长均能增大酿酒酵母的菌数减少指数；对不同生长时期酿酒酵母进行杀菌，表明荔枝汁中处于4个不同生长时期的酿酒酵母对电场敏感度不同，由强到弱依次为稳定期＞对数期＞衰亡期＞调整期。PEF对酿酒酵母的灭菌效果随着电场能量输入的增加而增强。

高强脉冲电场；荔枝汁；灭菌

荔枝作为四大“岭南佳果”之一，味甜鲜美、汁多肉嫩、营养丰富，深受广大消费者的喜爱，具有一定的药效和滋补作用。但是由于荔枝生产地域集中、采摘期短，对新鲜荔枝进行即时深加工具有重要意义[1]。荔枝汁作为加工产品的一种形式，如果不经过合适的处理将很容易变质[2]。然而，荔枝汁热敏性很强，普遍认为不适合热灭酶、热杀菌等热处理工艺。

高强脉冲电场(pulsed electric field，PEF)技术是一种正在兴起的非热加工技术，具有非热(低温)高效连续杀灭微生物的特点，对食品天然营养、风味等影响较小[3-5]，能符合果汁灭菌要求[6-10]。因此PEF技术能够较好地保存果汁的营养物质，延长果汁的保存期[11]，具有广泛的应用前景。国外已有工业规模果蔬汁电场灭菌方面的研究[11]。本实验主要研究高强脉冲电场对荔枝汁中酿酒酵母的灭菌效果，初步探讨电场能量输入、灭菌效果和荔枝汁处理过程中温度升高之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

荔枝汁由广东省帝浓酒业有限公司提供，冷藏贮存，实验时经高速冷冻离心机离心，取上清液备用；酿酒酵母菌种由华南理工大学轻工与食品学院微生物实验室提供。

1.2 培养基与试剂

麦芽琼脂培养基(麦芽膏粉130g/L、琼脂15g/L、氯霉素0.1g/L) 广东环凯生物科技有限公司；氯化钠(分析纯) 天津市福晨化学试剂厂。

1.3 仪器与设备

721 型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HHS电热恒温水浴锅 上海三申医疗器械有限公司；电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；手提式不锈钢蒸汽灭菌锅 上海沪南科学仪器厂；高强脉冲电场连续处理装置(主要由示波器、脉冲发生器、处理室、负载电阻、恒流泵组成。脉冲电场参数为：电场强度0～35kV/cm 连续可调，脉冲频率为1.0kHZ，脉冲宽度25μs。处理室电极材料为不锈钢，绝缘部分为聚四氟乙烯，容量为0.02mL，波形为平方波) 华南理工大学脉冲电场研究组自行设计开发。

1.4 方法

不同生长环境及不同培养基都会对酿酒酵母生长有一定的影响。为了研究PEF对荔枝汁中处于各个生长时期的酿酒酵母的灭菌效果，实验首先对酿酒酵母在荔枝汁中的生长情况进行测定。

1.4.1 菌种生长曲线的测定

1.4.1.1 菌种的恢复培养

冻干菌种装在小试管内，用划线法将菌种转至斜面培养基中进行培养。30℃恒温培养48h，使菌种复壮。

1.4.1.2 扩大培养

在培养好的试管中加入无菌液体培养基，用无菌接种环将斜面上的菌落剥离，摇匀，制成菌悬液，接种到无菌的容量为1L并装有300mL 液体培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/min 振荡培养20h，此时培养液浑浊。

1.4.1.3 生长曲线的测定

将分光光度计波长调整到560nm，预热30min。以未接种的荔枝汁培养液校正零点。取盛有300mL 无菌荔枝汁培养液的1000mL锥形瓶1个，加入振荡培养20h的细菌培养液30mL，30℃恒温培养。于培养后的36h内每隔2 h用无菌移液管从瓶中吸取培养液样，在波长560nm处测定OD值。

1.4.2 灭菌效果测定

采用混合平板培养法于36℃恒温培养箱培养，并计算PEF处理前后荔枝汁中的活菌总数。灭菌效果采用菌数减少指数表示。

式中：N为脉冲电场处理后的菌落总数/(CFU/mL)；N0为脉冲电场处理前的菌落总数/(CFU/mL)。

1.4.3 PEF能量输入计算

脉冲个数以及总处理时间的计算见公式(2)、(3)[12-13]。

式中：n为脉冲个数；t为总处理时间；V为处理室体积/mL；f为脉冲频率/Hz；u为流速/(mL/s)；τ为脉冲持续时间/μs。

电场输入能量计算见公式(4)[14-16]为：

式中：Q为输入能量/(J/m3)；E为电场强度/(V/m)；为一定温度下样品的电导率/(S/m)；t为总处理时间/s。

2 结果与分析

2.1 荔枝汁中酿酒酵母的生长曲线

图1 酿酒酵母在荔枝汁中的生长曲线Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae in litchi juice

由图1可以看出，酿酒酵母在荔枝汁中培养0～10h内，生长缓慢，处于调整期。随后进入对数生长期，曲线呈快速上升趋势。培养28h时菌体生长进入稳定期。然后在很短时间内由稳定期进入衰亡期，生长曲线急剧下降。本实验以荔枝汁中培养酿酒酵母菌5、20、30、35h分别代表荔枝汁中酿酒酵母生长的4个不同时期。

2.2 PEF对荔枝汁中处于稳定期的酿酒酵母灭菌效果

PEF对微生物的作用效果影响因素较多，其中最重要的因素是电场强度和处理时间。实验首先以这两个因素对灭菌效果的影响进行探讨。

脉冲电场强度为3、7、10、13、17、20kV/cm，处理时间为1000、750、600μs时不同电场强度不同处理时间条件下脉冲电场对荔枝汁中处于稳定期(荔枝汁中培养30h)的酿酒酵母灭菌效果见图2。

图2 不同电场强度和不同处理时间对荔枝汁中处于稳定期的酿酒酵母的灭菌效果Fig.2 Sterilization effect of PEF treatment at various intensities and treatment time on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice

由图2可以看出，随着电场强度的升高，酿酒酵母菌数减少指数增大。处理时间延长，菌数减少指数也不断增大。当电场强度为20kV/cm、处理时间为1000μs时，PEF处理后酿酒酵母的菌数减少指数达到4.13。可见，在本实验范围内，随着电场强度的增强和处理时间的延长，PEF对荔枝汁中的酿酒酵母的灭菌效果更加明显。

2.3 高强脉冲电场对荔枝汁中处于不同生长期的酿酒酵母的灭菌效果

酿酒酵母处于不同的生长期对灭菌效果也会产生影响，将荔枝汁中培养酿酒酵母5、20、30、35h分别代表酿酒酵母生长的4个不同时期进行如下实验研究。由图3可看出，PEF对荔枝汁中处于稳定期的酿酒酵母菌数减少指数最大，灭菌效果最好。其他3个时期灭菌效果依次为对数期＞衰亡期＞调整期。结果说明，

图3 不同电场强度对荔枝汁中处于各个生长期的酿酒酵母的灭菌效果Fig.3 Sterilization effect of PEF treatment at various intensities on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice during different growth phases

处于稳定期的酿酒酵母对电场最为敏感。尽管脉冲电场的杀菌机理目前尚不确定，但其中被大家普遍认同的电崩解理论和电穿孔原理均认为在外加电场作用下，微生物的细胞膜发生了一定的改变，最终导致微生物的死亡[17-19]。酿酒酵母处于稳定期时，由于荔枝汁中营养物质的不断消耗，各种代谢产物的不断积累，细胞膜更容易受到电场的影响，从而使得PEF对稳定期的酿酒酵母的灭菌效果最好。

2.4 高强脉冲电场不同能量输入对处于稳定期的酿酒酵母的灭菌效果

图4 不同电场输入能量对荔枝汁中稳定期酿酒酵母的灭菌效果Fig.4 Sterilization effect of PEF treatment at various energy inputs on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice during stable growth phase

通过公式(4)计算不同的电场强度及处理时间时的电场输入能量，从能量的角度考察PEF对酿酒酵母的灭菌效果。

由图4可以看出，随着电场输入能量的增加，PEF对荔枝汁中的稳定期酿酒酵母的菌数减少指数不断增加，灭菌效果越来越好。通过线性拟合可知，电场输入的能量和菌数减少指数具有一定的线性关系即y= 0.0018x+2.0482，线性相关系数(R2)为0.9794。当输入的能量由15.16J/mL升至1123.12J/mL时，PEF对酿酒酵母的菌数减少指数相应由2.15提高到了4.13。

2.5 PEF不同输入能量对各生长期酿酒酵母灭菌效果

图5 不同电场输入能量对荔枝汁中处于各个生长期的酿酒酵母的灭菌效果Fig.5 Sterilization effect of PEF treatment at various energy inputs on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice during different growth phases

由图5可以明显看出，荔枝汁中处于4个生长期的酿酒酵母均随着电场输入能量的增加菌数减少指数增大。处于4个不同生长时期的酿酒酵母对能量敏感度由强到弱分别是稳定期＞对数期＞衰亡期＞调整期，实验结果类似于2.3节。

2.6 PEF输入能量与荔枝汁温度之间的关系

处于各个生长期的酿酒酵母均随着能量输入的增大，灭菌效果增加。但是由于能量输入增大会相应导致荔枝汁温度的不断升高。所以实验取处理时间为600μs，以PEF对稳定期酿酒酵母灭菌过程建立输入能量与荔枝汁样液温度的关系。

表1 高强脉冲电场输入能量与荔枝汁温度升高之间的关系Table 1 Relationship of PEF energy input and temperature in litchi juice

如表1所示， PEF对荔枝汁的灭菌过程中随着电场强度的不断增加，电场输入能量不断增加，荔枝汁温度升高值也不断增加。当电场强度为20kV/cm时，温度升高了30℃，菌数减少指数达到了3.30。虽然处理过程中荔枝汁的温度升高比起热处理过程比较小，但是仍可能导致荔枝汁风味的改变。所以可以考虑调整荔枝汁处理时的流速和电场，如增大电场强度同时增大处理时间，或者在一定处理时间下减小电场强度，达到要求的灭菌效果。

3 结 论

PEF对于荔枝汁中的酿酒酵母具有明显的杀菌效果。在电场强度为20kV/cm，处理时间为1000μs，时酿酒酵母的菌数减少指数达到4.13。

荔枝汁中处于4个不同生长时期的酿酒酵母对电场敏感程度不同，由强到弱依次为稳定期＞对数期＞衰亡期＞调整期。可以看出PEF对荔枝汁中处于稳定期的酿酒酵母杀菌效果最好。

电场强度的增大以及处理时间的延长均使电场输入的能量增加。实验结果显示，随着电场输入能量的增加，酿酒酵母的菌数减少指数增加，即灭菌效果越来越好。电场输入能量的增加导致处理时荔枝汁温度的不断升高。当电场强度为20kV/cm处理时间为600μs时，温度升高了30℃，菌数减少指数达到3.30。

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Sterilization Effect of Pulsed Electric Field on Saccharomyces cerevisiae in Litchi Juice

LIU Xin-yu，ZENG Xin-an*，JIA Xiao
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The sterilization effect of pulsed electric field (PEF) treatment on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice was investigated. Results indicated that the lethality of Saccharomyces cerevisiae treated by PEF was increased as the increase of electric field strength and pulsed treatment time. The survival microorganisms exhibited a reduction of 104folds when subjected to the pulsed electric field treatment at 20 kV/min for 1000μs. The sensitivity of PEF treatment during different growth phase of Saccharomyces cerevisiae exhibited an order from strong to weak as stable phase, logarithmic phase, decline phase and adjustment phase. A better sterilization effect of PEF treatment was also observed at the condition of enhanced energy input.

high-intensity pulsed electric field；litchi juice；sterilization

TS255.44

A

1002-6630(2011)03-0091-04

2010-04-29

广东省国际合作项目(2009B050400003)；广东省自然科学基金项目(9151008901000159)

刘新雨(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为脉冲电场对食品成分的影响。

E-mail：liuxinyu228@yahoo.com.cn

*通信作者：曾新安(1972—)，男，教授，博士，研究方向为食品绿色加工。E-mail：xazeng@scut.edu.cn