人黑素细胞体外培养条件的研究进展

周梅华，鲁 严

人黑素细胞体外培养条件的研究进展

周梅华，鲁 严

从培养人黑素细胞的基本培养液、添加剂、紫外线以及共培养系统等方面综述安全、有效的黑素细胞体外培养条件的研究进展；同时总结了人毛囊无色素性黑素细胞、永生化黑素细胞的培养条件，对色素疾病的基础研究及临床治疗有重要意义。

黑素细胞；培养条件

[J Pract Dermatol, 2011, 4(1):30-33]

黑素细胞（melanocyte，MC）体外培养是研究黑素细胞增殖及黑素合成过程、揭示色素沉着异常及色素性疾病的病因、病理生理等的重要手段。黑素细胞体外培养的组织来源主要是人的表皮，常采用负压吸引水疱法、浅表皮肤活检术、包皮环切术等获取[1,2]。取下的表皮可单独或联合使用胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、中性蛋白酶（Dispase Ⅱ）等进行消化[1-3]，获得黑素细胞悬液，进行培养。近年来广大学者在黑素细胞的体外培养条件方面不断探索, 取得了一定的进展，现综述如下。

1 黑素细胞的培养条件

1.1 黑素细胞基本培养液

黑素细胞的基本培养液主要提供黑素细胞生长的最低需求，包括改良Eagle培养基（dulbecco modifed eagle medium，DMEM）、Ham培养液、RPMI1640培养液等[2-4]。DMEM是在细胞生长最低必需培养基（minimum essential medium，MEM）的基础上改良制成，适用于多种细胞系和组织的生长。Ham培养液包含Ham'F10 、Ham'F12，适用于细胞克隆化培养，其中F10适用于人二倍体细胞；F12在配方中添加了一定量的微量元素，可以在血清含量较少（2%～10%）的情况下培养细胞。RPMI1640培养基广泛适用于黑素细胞在内的多种细胞的原代和继代培养。

1.2 抑制成纤维细胞和角质形成细胞生长

抑制成纤维细胞和角质形成细胞生长是保障成功纯化培养黑素细胞的先决条件。常用抑制剂有12-0-十四酰佛波醇l3-乙酸酯（TPA）+霍乱毒素（CT），抑制成纤维细胞和角质形成细胞贴附和生长，但由于TPA具有强致癌性，CT也是一种神经毒素，所培养黑素细胞的安全性受到质疑，临床应用受到限制；还可以应用基因素（geneticin），选择性去除快速增殖的成纤维细胞，Hu等[3]在黑素细胞培养基中加入100ug/ml的geneticin，5～7天污染的成纤维细胞全部被去除；此外国内有学者使用自制的抗角蛋白自身抗体（antikeratin auto antibody，AK auto Ab）可选择性去除角质形成细胞。

1.3 添加剂作用

正常情况下，体外培养的黑素细胞生长缓慢、增殖能力弱，因此需要在黑素细胞培养基中添加各种因子以刺激黑素细胞增殖、分化及黑素形成，根据其作用可分为以下几种。

1.3.1 促进黑素细胞的增殖和分化作用

TPA：TPA在黑素细胞体外培养中不仅能抑制成纤维细胞及角质形成细胞生长，还能促进黑素细胞的增殖和分化。二脂酰甘油/蛋白激酶C（DAG/PKC）信号转导途径在调节细胞增殖和生长的信号转导中起重要作用。TPA可取代DAG活化PKC，刺激黑素细胞的增殖，增加树突，促进黑素细胞的附着。1982年M Eisinger等在培养基中添加TPA、CT等，首次体外培养黑素细胞取得成功，这一方法后被许多学者采用。但由于TPA是强致癌剂，体内不易代谢。当用TPA慢性处理细胞时，可引起PKC持续活化、降解，最终使细胞内PKC耗竭，进而对外部抑制信号的反应性降低，细胞不断地增殖，存在一定的致癌风险。因此限制了临床应用。

CT和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）：环磷酸腺苷/蛋白激酶A （cAMP/PKA）信号转导途径在细胞的增殖和转化中具有重要的调节作用。CT是PKA的激动剂，而IBMX为磷酸二酯酶抑制剂,减少细胞内cAMP分解。CT和IBMX通过不同方式激活cAMP/PKA途径，提高细胞内cAMP的水平，促使黑素细胞分裂。Chen等[5]采用Hu16 培养基（在F12基本培养液中添加bFGF、IBMX、CT、FCS），获得自体纯黑素细胞悬液, 移植治疗120例白癜风患者。由于CT是一种神经毒素,而IBMX不是人体自然存在物质，所培养的黑素细胞安全性受到质疑。

生长因子类：许多生长因子具有刺激受体型酪氨酸激酶的丝裂原活性，通过丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）级联途径，促进体外黑素细胞的大量增殖。

①碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）：bFGF是一种广谱有丝分裂剂，可以刺激黑素细胞的生长,是黑素细胞的天然分裂剂。bFGF刺激丝裂原激活的蛋白激酶2（MAPK2）和转录因子Ca2+/cAMP应答元件结合蛋白（CREB），通过MAPK级联反应使黑素细胞由G1期进入S期， 促进黑素细胞增殖。bFGF不仅是黑素细胞的促分裂剂，还是酪氨酸酶受体和蛋白激酶C（PKC）的激活剂，通过形成bFGF→激活酪氨酸激酶→激活酪氨酸酶→黑素生成这一级联反应，刺激黑素细胞色素的生成及树突生长。

②肝细胞生长因子（HGF）：HGF是一种多功能的生物因子，它能够刺激多种上皮、内皮和间质细胞的生长、血管生成、免疫调节活性，促进细胞增殖、移动和侵袭[6]。HGF的受体C-MET具有酪氨酸激酶活性，通过C-MET激活MAPK途径发挥多种功能。在黑素细胞培养基中加入HGF能够促进黑素细胞的增殖和分化，而在其中加入抗HGF的抗体则能抑制成黑素细胞和黑素细胞的增殖[7]。实验表明HGF能促进眼睛和皮肤的黑素细胞生长。

③粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）：GM-CSF由角质形成细胞分泌，与特定受体GMCSFR结合，通过激活信号转导蛋白及转录活化剂（STAT-1、STAT-3和STAT-5）或促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），诱导黑素细胞增殖必需蛋白的增量调节[8]，参与调节黑素细胞的增殖与分化。Hirobe 等[9]将小鼠黑素细胞置于加入GM-CSF的培养基中培养，GM-CSF诱导了黑素细胞的增殖和分化，在其中加入抗GM-CSF的抗体则抑制黑素细胞的增殖和分化，而对照组无反应。

④内皮素（ET）：内皮素（ET）是体内天然存在的生理性因子，其家族成员包括ET-1、ET-2、ET-3。ET可以通过酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-l（TRP-1）、MAPK、PKC、PKA等信号通路促进人黑素细胞（MC）的增殖和黑素合成，其中ET-1效果最显著。ET-1具有促黑素细胞增殖、黑素生成、树突形成、细胞粘附、移行以及防止紫外线照射引起的MC凋亡等多种作用[10]。小眼相关基因转录因子（Mitf）能够启动酪氨酸酶基因，是黑素细胞增殖和黑素合成的关键转录因子。ET-1可通过结合内皮素-B受体使丝裂原激动蛋白激酶（ERK1/2）磷酸化，激活Mitf，促进培养黑素细胞树突数量增加，延长树突长度，并呈剂量依赖性[11]。Szabad等[12]认为bFGF、内皮素-1、α–MSH三者合用可以替代TPA和牛垂体浸膏（BPE）在体外培养黑素细胞的增殖作用。

⑤干细胞因子（SCF）：皮肤中的SCF主要来源于成纤维细胞、角质形成细胞和血管内皮细胞。SCF与黑素细胞表面的受体（KIT）结合，当KIT受体被激活后，上调Mitf的磷酸化作用，激活TYR基因，使皮肤中的黑素前体细胞首先分化成Mitf+细胞和TRP-2+细胞,然后这些细胞再转变成成熟的TRP-1+细胞[13]。SCF/KIT途径在维持黑素细胞的存活、诱导迁移、促进增殖与分化中起了极为关键的作用。最新发现ET-1和SCF在cAMP和bFGF的协同作用下可以调节人类黑素细胞的生命周期，促进黑素细胞的增殖和分化[14]。

1.3.2 促黑素形成作用

α-黑素细胞刺激素（α-MSH）：α-MSH是一种内源性神经肽，来源于其前体激素阿黑皮素原（POMC）。α-MSH和黑皮素受体-1（MC-1R）结合,活化腺苷酸环化酶，提高细胞内环磷酸腺苷（cAMP）浓度，从而增强酪氨酸酶（TYR）的合成及表达,促进黑素合成。α-MSH还可促进黑素细胞（MC）树突形成，但机制尚不清楚，可能受MC1R介导的胞内多种信号途径的调控。在含α-MSH的培养条件下，体外培养的MC形成树突的数目增加，形态亦更接近于体内状态。

ET-1是一种纤维原细胞增长因子。ET-l在黑素生成过程中的作用与SCF/c-kit系统有关[15]。ET-1和α-MSH相互协同,通过增加酪氨酸酶的活性、提高酪氨酸酶相关蛋白1, 2的水平来刺激黑素的合成。

bFGF不仅是黑素细胞的促分裂剂,还是酪氨酸酶受体和蛋白激酶C（PKC）的激活剂,刺激黑素细胞色素的生成及树突生长。

1.4 其他添加剂

血清能提供细胞增殖所必需的营养物质和生长因子，由于血清成分不明,胎牛血清可能包含异体蛋白而导致变态反应。Czajkowski等[17]运用无血清培养基（melanocyte growth medium，M2）培养黑素细胞,成功建立了原代培养，但有一半的患者无法获得移植所需的足够的细胞株。无TPA/CT和胎牛血清（FCS）的培养基虽然能获得用于临床移植的安全细胞株，但同时减少了黑素细胞的增殖率，这大大延长了培养时间，有时甚至导致培养失败。

2 紫外线对体外培养黑素细胞的作用

紫外线是一种外源性的促细胞分裂剂。表皮存在一个复杂的旁分泌和自分泌网络调节着人类黑素细胞的生存、增殖和功能，这个网络通过紫外线作用而上调。受紫外线上调的因子包括α-MSH、ET-1、GM-CSF、SCF、bFGF、一氧化氮（NO）和组织胺等因子。中波紫外线UVB能够刺激黑素细胞的增殖、移行及黑素合成。UVB诱导黑素生成是通过一氧化氮/环磷酸鸟苷/蛋白激酶G（NO/cGMP/PKG）途径介导的。Larsson等[16]研究表明UVB诱导产生的黑素细胞DNA损伤片段可以激活酪氨酸酶的活性，从而促进黑素合成。Mulekar[18]在培养黑素细胞时加照紫外线，培养出的黑素细胞较未照紫外线的黑素细胞明显活跃，表现为双极、三极或多极树突状，数量明显增加，细胞轮廓较明显，移植活性更强。UVB还可以促进角质形成细胞释放促黑素细胞增殖分化的因子如内皮素-1、IL-1a、成纤维细胞生长因子等。且UVB具有免疫抑制作用，可使移行及增殖的黑素细胞免受破坏。

3 黑素细胞与角质形成细胞或成纤维细胞共培养

角质形成细胞（KC）可分泌多种细胞因子，包括α–MSH、bFGF、神经生长因子（NGF）、内皮素（ET）、白介素- 1（IL-1）、GM-CSF及干细胞因子等，通过受体介导的信号通路调节黑素细胞的增殖和分化。KC对MC的生物学性状也非常重要，MC可在移植部位形成色素沉着，而KC促进伤口快速愈合而不留瘢痕, 可获得色素恢复和皮损愈合的双重功效。因此角质形成细胞-黑素细胞共培养移植被众多学者采用。当共培养中的KC密度过高时，可引起MC数目下调、活力下降。Eves等[19]建立了一种适合KC和MC共培养系统-化学成分处理的基质(丙烯酸、丙烯胺或这两种单体的混合物与血浆聚合产生)和M2无血清培养基相结合，可以解决上述问题。

成纤维细胞产生的有丝分裂原可影响黑素细胞的生物学特征。Imokawa等发现培养4天的成纤维细胞介质可显著刺激黑素细胞DNA的合成，且取自老化皮肤的纤维细胞的这种作用高于年轻皮肤的成纤维细胞。进一步研究发现两者的介质中前者的HGF、干细胞因子高于后者，且加入抗HGF或抗SCF后，MC DNA合成下降32%，说明成纤维细胞分泌的HGF和SCF可刺激MC的DNA合成。

4 人毛囊无色素性黑素细胞（AMMC）培养

黑素细胞起源于神经嵴，在胚胎发育2～5 周开始向表皮和毛囊移行[20]。研究表明毛囊无色素性黑素细胞（AMMC）可以作为皮肤黑素细胞的储库，给白癜风的治疗提供黑素细胞来源。由于AMMC在毛囊中的含量少，体外生长增殖缓慢，易被角质形成细胞和成纤维细胞污染，但可通过添加一些特殊的促生长因子纯化培养AMMC。这些因子包括：①多肽类生长因子：如表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、SCF；②提高细胞内环磷酸腺苷水平的因子，如霍乱毒素；③蛋白激酶激动剂，如IBMX，TPA等[21]。培养中采用差别胰酶法去除角质形成细胞的污染[22]，采用100μg/ml的geneticin 处理去除成纤维细胞污染[21]。

5 永生化黑素细胞培养

通过转染外源性基因，能够调控和影响细胞的生长周期和增殖，获得正常黑素细胞来源的永生化细胞株，为临床研究提供细胞来源。常用的外源性基因有SV40T抗原、HPV的E6/E7、端粒酶逆转录酶等等，均成功构建了永生化的细胞系。由于诱导细胞的永生化多是外源性的原癌基因，存在潜在致癌性和病毒感染的可能，一定程度上限制了在临床中的应用。Eaton等[23]提出利用Cre/loxP位点特异性重组酶系统联合SV40TAg基因，使细胞既能无限增殖又无潜在的致癌性，可安全用于临床。

6 结语

建立新型、安全、高效、经济的黑素细胞体外培养方法，为黑素细胞基础研究及临床黑素细胞移植治疗白癜风提供理想的细胞来源，特别是后者临床疗效具有广阔的应用前景。

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Conditions of human melanocytes in vitro culture

ZHOU Mei-hua，LU Yan
Department of Dermatology and Venereology, the First Affliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China

This article summarys safe and effective cultured conditions of human melanocytes in vitro from the basic culture medium, additives, UV and co-culture system. Besides, it sum up the cultured conditions of the hair follicle amelanotic melanocytes and immortalized melanocytes. It is of great significance to the basis research and clinical treatment of the pigment diseases.

Melanocyte；Cultured conditions

R329.499.1

A

1674-1293(2011)01-0030-04

周梅华

2010-09-07

2011-01-20）

（本文编辑 祝贺）

江苏省社会发展计划项目（BS2007072）

210029，南京医科大学第一附属医院皮肤性病科（周梅华，鲁严）

周梅华，女，硕士研究生，研究方向：皮肤色素性疾病，E-mail: zmhsmm@163.com.cn

鲁严，E-mail: luyan1971@yahoo.com.cn