电项针疗法对脑缺血再灌注大鼠ICAM－1及ICAM－1 mRNA表达的影响

朱肖菊，王晓杰

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

脑血管病是目前严重威胁人类健康的疾病之一，占我国居民死亡原因第3位，具有发病率高、病死率高、致残率高的特点［1］。伴随着溶栓疗法的运用，再灌注损伤的问题受到越来越多的重视。其中，脑缺血再灌注损伤时的炎症反应可以促进脑梗死的继发性脑损害［2］。治疗和预防缺血性中风并降低其发病率和致残率，已成为亟待解决的问题。

本研究通过原位杂交技术和免疫组化方法对缺血再灌注大鼠不同时点的细胞间黏附分子－1(ICAM－1)蛋白及其mRNA表达的检测，旨在对电项针疗法在治疗急性脑缺血再灌注损伤时的神经保护作用的机制进行进一步探讨。

1 材料与方法

1．1 材料

成年健康雄性 Wistar大鼠，体重280～320 g。ICAM－1免疫组化试剂盒、ICAM－1原位杂交试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供;DAB显色试剂盒由北京中杉金桥生物公司提供。

1．2 方法

1．2．1 分组

实验大鼠共96只，随机分成4组:(A组)假手术组、(B组)模型组、(C组)电体针组、(D组)电项针组，每组各24只，又随机将每组大鼠分成12 h、1 d、3 d、5 d共4个时点，平均每个时点各6只鼠。

1．2．2 模型制备

用直径约0.25 mm的单尼龙缝合线60 mm制作线栓，将一端加热熔化成光球状。大鼠术前禁食12 h。参照Zea－longa方法［3］，先将大鼠进行麻醉后，使其仰卧，碘伏进行颈部皮肤消毒并将毛发减去。在自胸骨角开始直至距离大鼠下唇1 cm处做一正中切口。暴露颈右侧和前部肌群，暴露大脑中动脉并找到其分叉处，此时可见颈外和颈内动脉。结扎颈外动脉的下部，将两根丝线穿置于大脑中动脉近心端下部备用。为防止在结扎大脑中动脉时迷走神经受到损伤，此时应注意迷走神经和大脑中动脉的分离。用血管夹在近大脑中动脉的分叉处将此动脉夹紧。在距离大脑中动脉的分叉处大约1 cm的血管壁上剪一个小切口，将线栓插入切口，结扎大脑中动脉切口远心端的丝线，再将血管夹松开后继续插送线栓。当线栓位于距离大脑中动脉分叉处大约1.8～2 cm处，手下有阻力感时则停止插入。成功插入线栓后，将皮肤缝合，栓线尾端暴露于皮外。假手术组大鼠只分离颈内动脉，不结扎插线。大鼠脑缺血2 h后轻度将线栓向外拉直至遇到阻力时则停止，将露于皮肤外面的栓线剪去，制作模型手术结束。

术后2 h若大鼠出现以下体征和症状则表示模型制作成功:提尾悬空观察大鼠时，则可出现病灶对侧的前肢呈抬高、屈曲姿势，肘关节呈伸直状态、肩内收;病灶的同侧可出现眼部霍纳氏征，病灶对侧的前爪无法伸展;行走时出现向病灶对侧转圈和倾倒等现象。假手术组则出现同侧的Horner征，而对侧肢体无瘫痪。

1．2．3 针灸选穴及操作

假手术组和模型组术后不进行治疗。治疗组的大鼠在清醒后立即进行针灸治疗。参照《大鼠穴位图谱》的定位，电体针组取左侧外关穴、曲池穴、昆仑穴和足三里穴，进针后进行捻转约1 min，连电针。将正极放在上，负极放在下，用一对导线将外关穴和曲池穴接为一组，昆仑穴和足三里穴连接为另一组，使用疏波，频率1 Hz，输出电压1 V，留针时间30 min，每日1次。电项针组则取双侧供血穴和风池穴。其中，供血穴位于第4颈椎旁开约2 mm处，进针捻转1 min后，连电针，电针操作方法如电体针组。

对4组大鼠在手术后12 h、1 d、3 d和5 d进行神经功能缺损评分后，对其灌注固定取脑。范围包括从额极至枕极每间隔2 mm平行做5个冠状切面，取第3和第4脑片并放置在4%多聚甲醛固定液中进行固定。后经常规脱水、透明和石蜡包埋后连续冠状切片，以便对脑组织形态学进行观察和对原位杂交及免疫组织化学的检测时使用。

1．2．4 检测观察方法

采取HE染色的方法对脑缺血再灌注后大鼠的脑组织形态学的变化进行观察;运用原位杂交技术和免疫组织化学的方法检测观察脑组织ICAM－1蛋白及其mRNA表达的变化。

1．2．5 阳性评定及统计学分析

光镜下阳性细胞的特征是细胞内或核膜上出现棕黄色斑片或颗粒。染色后在每张切片上于缺血侧基底节区和大脑皮层处随机采集5个高倍视野，进行阳性细胞数目的检测并取平均值。数据表示用均数±标准差(±s)，组间比较运用SPSS 13．0统计软件进行单因素方差分析数据。双侧检验则以P＜0.01及P＜0.05说明差别有统计学意义。

2 实验结果

2．1 大鼠脑组织形态学的变化

假手术组:神经细胞形态完整，核仁清晰，各时间点均无梗死灶的出现和炎性细胞的浸润。模型组大鼠在再灌注3天时可见大部分的神经元坏死、崩解;梗死中心边缘较清楚，坏死彻底。缺血半暗区神经元的密度减小，出现胶质细胞和炎性细胞浸润增多的现象，且细胞周围之间的间隙呈现增大的趋势。在脑缺血再灌注5天时，可观察到有少量的胶质细胞在梗死灶的周围增生的现象。在脑缺血再灌注天3天时，治疗组的大鼠出现神经细胞的肿胀程度呈现减轻的趋势，核仁清楚可见，但结构不清楚，并可观察到有少量的固缩神经元。在脑缺血再灌注5天时，在梗死灶的周围可观察到有毛细血管少量的增生。此外，电项针组大鼠还可观察到在梗死灶周围有粗大的轴突出现，且轴突反应和胶质细胞增生的情况较电体针组明显。

2．2 ICAM－1免疫组化结果

本研究结果显示:假手术组在各时点均无ICAM－1蛋白及其mRNA的阳性信号表达;模型组大鼠在再灌注12 h时，脑缺血区ICAM－1蛋白开始表达，此时ICAM－1mRNA表达达到高峰，12 h以后表达开始逐渐下降，而ICAM－1蛋白的表达于再灌注1天时达到峰值，以后表达开始逐渐减少。在光镜下显示:若观察到黄褐色毛细血管内皮细胞即为阳性表达;ICAM－1蛋白和mRNA的表达数量于大鼠脑缺血再灌注3天时显著减少，5天时渐降到脑缺血前的状态。治疗组在各个时点ICAM－1蛋白和mRNA阳性表达的程度较模型组低，且差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。治疗组各个相应时点比较差异显著 (P＜0.05)，电项针组表达的下降程度高于电体针组。见表1、表2。

表1 不同时点各组大鼠ICAM－1表达的阳性细胞数目(±s)

表1 不同时点各组大鼠ICAM－1表达的阳性细胞数目(±s)

注:与 B组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01;与 C 组比较，△P ＜0．05。

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表2 不同时间点各组大鼠ICAM－1mRNA表达的阳性细胞数目(±s)

表2 不同时间点各组大鼠ICAM－1mRNA表达的阳性细胞数目(±s)

注:与B组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与C组比较，△P＜0.05

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3 讨论

细胞间黏附分子－1(ICAM－1)是免疫球蛋白超家族成员，广泛表达在免疫细胞、上皮细胞、神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞等多种细胞，参与细胞与细胞间、细胞与基质间信号交换，介导细胞黏附、识别、活化、增殖、分化、炎性反应发生、肿瘤转移以及损伤修复等多种病理生理功能［4］。脑缺血再灌注后由于大量的炎性细胞因子的生成并刺激缺血半暗区的神经元表达粘附分子－1，对白细胞的粘附起促进作用，进而使白细胞的破坏作用得到加强，扩大了梗死面积。因此尽早地抑制ICAM－1的过高表达是极为必要的。

项针疗法治疗脑部疾病是现代医学腧穴解剖和传统的针刺技术相结合的一种新方法［5］。目前，有关项针的实验室基础研究正在开展［6～7］。电项针疗法是将毫针刺入项部腧穴后，再通以脉冲电流用以头颈部疾病治疗的一种方法，此法简单、实用性较强并适于推广。如今，此疗法已运用于脑梗死、延髓麻痹、耳鸣、耳聋、共济失调、美尼尔氏病等病的治疗，并在临床实践中取得了明显的效果。在前人研究的基础上，本实验对电项针的作用机制做了进一步的研究，以期为临床治疗提供依据。

由于椎动脉走行于供血穴和风池穴的深部，继而上升为大脑基底动脉以后，进入大脑Will氏环而使整个脑组织得到充足的血液供应。因此，以腧穴解剖学的原理为依据，本实验选取了这两个穴位。由于风池穴的深层有椎动脉、椎静脉及枕大、小神经的分支分布，浅层有枕小神经和枕动、静脉的分支分布。供血穴的深层分布有椎动脉、椎静脉和伴行的脊神经后支。对供血穴进行针刺可使椎－基底动脉血流速度得到改善，从而改善脑部血液的循环。

本研究结果提示:电项针疗法可能是通过下调ICAM－1蛋白和mRNA的表达，使炎性介质的释放受到抑制，从而使再灌注后炎症反应得到减轻。

［1］ 徐虹，洪礼传，黄艳秋，等．针刺对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织基质金属蛋白酶、细胞间黏附分子表达的影响［J］．基础医学与临床，2010，30(7):731 －733

［2］ 闻公灵，娄季宇，白宏英．bFGF对脑缺血再灌注大鼠ICAM－1表达及脑组织含水量的影响［J］．中国实用神经疾病杂志，2010，13(17):10－12

［3］ Zea－ longa E，Weinstein PR，Carlson，et al．Reversible middle cerebral arteryocclusion without craniectomy in rat［J］．Stroke，1989，20(1):84－91

［4］ Ostrow sk iRP，Jadhav V，ChenW，et al．Reduced m atr ixme tallopro te inase activ ity and ce ll death a fter g loba l is chem ia in the bra in precond itioned w ith hyperbar ic oxygen［J］．A cta Neuroch irur Suppl，2010，106:47 －49

［5］ 杨续艳，郭淑颖，王锐，等．电项针疗法对大鼠脑缺血再灌注模型HIF－1α 及 HIF－1αmRNA 表达的影响［J］．针灸临床杂志，2009，25(3):33 －35

［6］ 张晓梅，高维滨．电项针对失眠大鼠促眠作用实验研究［J］．针灸临床杂志，2008，24(10):40 －41

［7］ 倪金霞，高维滨，朱文增，等．项针疗法对急性脑梗死大鼠病理学及bcl－2表达的影响［J］．针灸临床杂志，2007，23(6):46－47