共表达ETEC K 99、K 88菌毛蛋白重组干酪乳杆菌的构建

温丽娟，王桂华，侯喜林，余丽芸，，王萌

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起仔猪腹泻疾病的主要病原菌之一[1-3]，给我国乃至全世界畜禽养殖业造成了巨大的经济损失。疫苗接种是预防该病的主要措施[4]，目前，国内外使用的接种疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，但灭活疫苗免疫原性差，而弱毒疫苗存在接种后动物机体排散病毒、病毒毒力返强等缺陷。针对ETEC主要经消化道和呼吸道黏膜感染的特点，研制能有效的刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进一步引起全身性系统免疫反应的新型疫苗，对该病的防治具有重要意义。

乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌，被公认为安全级（generally recognized as safe，GRAS）微生物[5]，具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸等能力，而且乳酸菌本身又具有低免疫原性，因此，以乳酸菌为载体作为外源基因的传递和表达系统研制口服疫苗，具有重要开发前景[6-12]。本研究选择能在肠道中定植的食品级微生物干酪乳杆菌作为递呈抗原物质的载体，采用一种新型的表面展示系统，利用多聚谷氨酸跨膜蛋白pgsA的锚定机制[13-15]，构建了表达K99-K88-LTB融合蛋白的重组干酪乳杆菌表达系统，并通过Western blot、间接免疫荧光技术及流式细胞术对表达于菌体表面的融合蛋白进行了鉴定。

1 材料和方法

1.1 菌株和质粒

产肠毒素性大肠杆菌标准菌株C83912由黑龙江八一农垦大学基因工程实验室保存；大肠杆菌pQEK88-LTB由黑龙江八一农垦大学预防兽医学实验室赠送；干酪乳杆菌表面表达载体pHCE1LB-pgsA（pLA）由黑龙江八一农垦大学基因工程实验室构建并保存；干酪乳杆菌CICC6105（Lactobacillus casei CICC6105）购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 主要仪器和试剂

PCR仪、电穿孔仪，美国BIO-RAD公司；荧光显微镜，德国 Lecia公司；流式细胞仪，法国 BECTON DICKINSON公司；Taq DNA聚合酶、Bam HⅠ、SalⅠ、Hin dⅢ等限制性内切酶及T4DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司；小量DNA质粒提取试剂盒、小量琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒购自TIANGEN公司；MRS培养基购自Sigma公司；HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG抗体购自Sigma公司；FITC标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；其它生化试剂均为国产分析纯产品。

1.3 引物

上游引物P1含Bam HⅠ酶切位点，下游引物P2含SalⅠ酶切位点，用于扩增K99基因，扩增的目的片段大小约498 bp；上游引物P3含SalⅠ酶切位点，下游引物P4含Hin dⅢ酶切位点，用于扩增K88ac-LTB基因片段，扩增的目的片段大小约825 bp；引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.4 重组质粒的构建

以标准菌株C83 912和重组菌pQE-K88ac-LTB为模板，利用各自设计的引物PCR扩增，分别获得K99基因片段和K88 ac-LTB基因片段，然后将纯化得到的基因片段连接到穿梭载体pHCE1LB-pgsA（pLA）[16]得到重组质粒命名为pLA-K99-K88 ac-LTB。按照Aymerich等[17]方法制备L.casei感受态细胞，将重组质粒及空载体质粒pLA在2.0 kV·cm-1、100Ω、25μF的电击条件下转化，电击时间约为4.5ms。电转化结束后，将转化子涂布于MRS固体培养基（含氯霉素34μg·mL-1），37℃厌氧培养24 h，挑选阳性菌落，按照Ian B.Powell等[18]方法从乳酸杆菌中提取质粒DNA，PCR鉴定阳性重组菌。

1.5 目的蛋白在干酪乳杆菌中的诱导表达及鉴定

将重组菌 pLA-K99-K88 ac-LTB/L.casei、pLA/L.casei接种于MRS液体培养基（含氯霉素34μg·mL-1）中，以pLA/L.casei为对照，37℃静置过夜活化，次日，分别按2%接种于10 mLMRS培养基中进行诱导表达。诱导表达6 h后，4 000 r·min-1离心5 min，收集沉淀；然后，菌体沉淀用400μL 10 mg·mL-1的溶菌酶 37℃水浴作用 40 min，4 000 r·min-1离心5min，弃上清，加入SDS-PAGE样品缓冲液，混匀，沸水浴10 min，12 000 r·min-1离心5 min，以蛋白质标准分子量为参考，取上清15μL，以10%的SDS-PAGE进行电泳。SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶中蛋白转印到硝酸纤维素膜上，分别以ETEC K99、K88多抗血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗；以pgsA多抗血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，DAB底物显色溶液中显色15 min，观察结果。

通过间接免疫荧光和流式细胞术检测目的蛋白在干酪乳杆菌表面的锚定[19]。

间接免疫荧光检测：取表达6 h后的阳性重组菌和空菌1mL，离心去上清后，PBS洗涤3次，重悬于PBS中，取适量涂片，冷无水乙醇固定30min，5%脱脂乳4℃过夜封闭，次日，PBST洗3次，于被检标本上分别滴加兔源抗pgsA多抗血清，置于湿盒中，4℃作用6～8 h，PBST洗3次，滴加FITC标记的荧光二抗（1∶100稀释），置于湿盒中，4℃（避光）作用过夜，PBST洗3次，最后用蒸馏水洗1次，甘油缓冲液封片后镜检。

流式细胞术检测：取表达6 h后的阳性重组菌和乳酸菌空菌0.5mL，用300目筛网过滤，4℃，4 000 r/min离心5 min，收集菌体，PBS洗3次，重悬于PBS中，调节菌体数达5×107-5×108CFU/mL，4℃，5%脱脂乳过夜封闭；次日，PBST洗3次，加入兔源抗pgsA多抗血清，4℃作用6～8 h，PBST洗3次，加入FITC标记的荧光二抗（1∶100稀释），4℃过夜作用；次日，PBST洗3次，重悬于PBS中在流式细胞仪上检测。

2 结果

2.1 K 99、K 88-LTB基因PCR扩增结果

以制备的染色体DNA和质粒DNA为模板，通过设计的特异性引物进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1条约498 bp的特异性条带和1条约825 bp的特异性条带（见图1 A、B），与预期DNA片段大小一致。

图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳Fig.1 1%Agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2 重组质粒的酶切鉴定结果

重组质粒经Bam HⅠ/SalⅠ、SalⅠ/Hin dⅢ、Bam HⅠ/HindⅢ双酶切，结果切出大小约为7 171 bp和498 bp、6 844 bp和825 bp、6 346 bp和1 323 bp等片段，与预期结果相符，筛选出阳性重组子pLA-K99-K88-LTB（见图2）。

2.3 PCR扩增干酪乳杆菌转化子的结果

以干酪乳杆菌转化子为模板，通过设计的ETEC K99、K88-LTB和枯草芽孢杆菌pgsA特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约498 bp、825 bp和1 116 bp等3条特异性条带，与预期DNA片段大小一致结果（见图3）。

图2 重组质粒pLA-K 99-K 88-LTB的酶切鉴定Fig.2 Identification ofpLA-K99-K88-LTB by enzyme digestion

图3 重组质粒PCR鉴定结果Fig.3 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.4 目的蛋白在干酪乳杆菌中的诱导表达及鉴定

2.4.1 重组蛋白的Western blot鉴定

重组菌表达产物经SDS-PAGE电泳后，转移到PVDF膜上，分别与鼠源抗K99（图4A）、K88（图4B）多抗血清作用，再经羊抗鼠IgG/HRP二抗作用，Western blot分析结果显示：在预期位置出现明显的条带（约90 kDa），与预计大小一致；而含空质粒pLA对照未见此目的条带，说明表达的蛋白可被鼠源抗K99、K88多抗血清所识别。

重组菌表达产物经SDS-PAGE电泳和PVDF膜转印后，与兔源抗pgsA（图4C）多抗血清作用，再经羊抗兔IgG/HRP二抗作用，Western blot分析结果显示：在预期位置出现明显的条带（约90 kDa），与预计大小一致；而含空质粒pLA对照可见其标签蛋白（约43 kDa），而未见此目的条带，说明表达的蛋白可被兔源抗pgsA多抗血清所识别。

图4 重组蛋白的anti-K 99（A）、anti-K 88（B）、anti-pgsA（C）W estern blot检测结果Fig.4 Western blotanalysis of the recombinant protein using anti-K99（A），anti-K88（B），anti-pgsA（C）antibody.M.

2.4.2 间接免疫荧光和流式细胞术鉴定

以L.casei为对照，与重组菌pLA-K99-K88 ac-LTB/L.casei共同进行间接免疫荧光实验，以兔源抗pgsA多抗血清（图5）为一抗，以羊抗兔IgG/FITC为二抗，试验结果表明：实验组可见明显的绿色荧光（图5A），对照组未见绿色荧光（图5B），明视野下可见与荧光视野下相同的细菌形态，由此表明，重组干酪乳杆菌表达了外源融合蛋白，初步表明表达的重组蛋白锚定于菌体表面。

图6 流式细胞术检测重组蛋白Fig.6 Fluorescence-activated cell sorter histograms of L.casei（open）and of the recombinant L.casei cells（filled）.The cellswere probed with rabbitanti-pgsA polyclonal antibodies，followed by FITC-anti-rabbit IgG antibody and fluorescein isothiocyanate-conjugated streptavidin.

以乳酸菌L.casei为对照，与重组菌pLA-K99-K88 ac-LTB/L.casei进行流式细胞术分析。试验结果表明（图6）：重组菌pLA-K99-K88 ac-LTB/L.casei的荧光信号强度明显高于乳酸菌空菌，结果与间接免疫荧光检测结果相符，进一步证明外源重组蛋白在干酪乳杆菌表面表达。

3 讨论

产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起仔猪腹泻的主要致病菌，给我国乃至全世界的畜禽养殖业带来了极大的危害，造成了巨大的经济损失。引起ETEC腹泻的主要致病因子和保护性抗原是黏附素（又称定居因子抗原）和肠毒素。ETEC感染宿主后，通过菌毛上的定居因子黏附于仔猪小肠上皮细胞，与上皮细胞的受体相结合，在小肠上皮细胞定植并大量繁殖，产生肠毒素，引起小肠上皮细胞代谢紊乱，最终导致腹泻而使仔猪致病。因此，黏附素与上皮细胞上的受体相结合是引起仔猪腹泻的前提条件[16，20]。引起仔猪腹泻的菌毛抗原主要有K88、K99、987P及F41，其中以K88菌毛抗原型的ETEC在我国流行性最广，K99次之。

对于ETEC的感染，目前对该病的防治多以药物和疫苗为主，但药物治疗价格昂贵，且耐药菌株日趋增多，因此疫苗预防是控制该病感染的最佳选择[4]。虽然国内外已有多种预防幼畜腹泻的灭活菌体疫苗，但灭活疫苗仅能诱发体液免疫应答，不能诱导细胞免疫和局部黏膜免疫应答，而且对后代主动免疫会产生严重干扰[21]，而弱毒活疫苗存在排散病毒、病毒毒力返强等不安全因素。针对ETEC主要经消化道和呼吸道黏膜感染的特点，研制能有效地刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答，进一步引起全身性系统免疫反应的疫苗，对该病的防治具有重要意义。

以细菌、病毒作为活载体均可达到这一目的，但从生物安全性及疫苗免疫效果角度出发，能在肠道黏膜定植的乳酸菌被认为是最合适的载体系统。

干酪乳杆菌是定植于人及动物肠道黏膜表面的重要益生菌群之一，具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力，而其本身又具有低免疫原性。因此，以干酪乳杆菌为载体，作为外源基因的传递和表达系统，研制口服疫苗，具有重要开发前景。

研究以食品级干酪乳杆菌CICC 6105作为递送疫苗抗原的活菌载体，利用能够在大肠杆菌和乳酸菌之间穿梭的表面表达载体pLA，构建了细胞表面表达ETEC K99、K88融合蛋白的重组干酪乳杆菌系统，以期利用该重组菌作为ETEC口服疫苗，达到同时预防ETEC细菌感染的目的。对构建的重组干酪乳杆菌表达的融合蛋白经Western blot免疫学检测分析，外源重组蛋白能够被阳性血清所识别，表明所构建的重组干酪乳杆菌表达系统能够有效的表达外源目的蛋白，重组蛋白与天然抗原一样具有相同的免疫原性。目前普遍认为，在宿主细胞表面表达外源抗原是活载体疫苗向黏膜免疫系统提呈抗原的最佳方式。研究所使用pLA表达载体是一种基于枯草芽孢杆菌pgsA的新型细胞表面表达系统，在此系统中，目的蛋白的N端可以和pgsA相连，进而使融合蛋白高效地表达在细胞表面。重组菌诱导表达后经间接免疫荧光和流式细胞术鉴定，结果表明重组菌表达的融合蛋白能够表达于菌体的表面。

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