消渴益肾方对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用的研究

张 洁

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes Mellitus，DM)最常见的并发症，也是导致终末期肾病的主要原因，目前尚无特效的治疗办法。以中医理论为基础，用中医药对糖尿病肾病进行防治，取得了一定的效果，显示出广阔的前景。消渴益肾方是我院的协定方，临床应用多年，效果良好。在临床应用的基础上开展了实验研究，采用单侧肾切除合并STZ诱导的DN模型，观察其对主要生化指标的影响，探讨其作用机制，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 纯种雄性 Wistar大鼠，体重180g～220g，周龄6～8周，由山东大学实验动物中心提供(动物合格证号SCXK(鲁)120030012)。

1.1.2 药物 消渴益肾方(黄芪30g，熟地黄20g，山药 12g，山茱萸 12g，枸杞子 12g，茯苓 20g，白术10g，泽兰10g，水蛭6g)，由潍坊市中医院药剂科提供。以上中药加10倍水浸泡2h煎煮，水沸后小火煎30min，过滤取汁;第2次加8倍水，重复上述操作，合并滤液浓缩成200%的药液(每毫升药液含2 g生药)，冷却后密封4℃保存。缬沙坦(80 mg/片，诺华公司生产)，实验动物用剂量:20 mg/kg，临用前用蒸馏水配制成混悬液，4℃保存。

1.1.3 试剂及仪器 链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司;大鼠血清转化生长因子 β1(TGF-β1)ELISA试剂盒，BPB公司(批号70621S);大鼠血清纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)ELISA试剂盒，BPB公司(批号2005060113);空腹血糖(FPG)测定试剂盒，德赛诊断系统有限公司;血胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)测定试剂盒，北京利德曼生化技术有限公司。7170S型自动分析仪，日本日制产业株式会社。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 按 Anderson等［1］建立的方法，将50只大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)后，左侧卧位固定，在脊柱与肋骨交界处备皮，剪开皮肤后钝性分离肌肉层，用手将右肾抵出切口，止血钳夹住肾血管，钝性剥离肾包膜，保留肾上腺，结扎血管后将右肾摘除，分别缝合肌肉和皮肤。假手术组分离肌肉层后再进行缝合即可。每只老鼠肌肉注射青霉素50U/d，3d。2周后切口完全愈合。

将大鼠空腹24h后，取10只作为假手术组，其余按45mg/kg腹腔一次性注射STZ，假手术组只注射相同体积的枸椽酸缓冲液，72h后尾尖取血，血糖仪测定血糖 ＞16.7mmol/L者确定为糖尿病模型。符合条件的大鼠共36只。

1.2.2 分组及给药方法 36只大鼠随机分为3组:模型对照组(生理盐水，3 ml/只);缬沙坦组(缬沙坦20mg/(kg·d)灌胃);消渴益肾方 +缬沙坦组(消渴益肾方1.015g/kg;缬沙坦20mg/(kg·d)，灌胃)。假手术组(生理盐水，3 ml/只)。根据体表面积剂量换算法确定给药剂量［2］，按1 ml/100 g体质量灌胃，每天1次，实验期间自由进食、饮水。观察8周。

1.2.3 指标测定 于第8周末，用代谢笼收集24h尿液检测尿白蛋白;然后禁食12h，动物用戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)固定，腹主动脉取血测FPG、BUN、Cr、TC、TG、TGF-β1、PAI-1。

1.2.4 统计学方法 数值变量以均数±标准差(珋x±s)表示，运用SPSS10.0软件进行统计学处理，如果正态并方差齐则采用单因素方差分析检验，如不齐，则采用秩和检验。分类变量应用成组设计多个样本比较的秩和检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 各组大鼠生活习性的变化

表1显示，造模成功的大鼠均有不同程度的毛色暗淡，精神萎靡，体重减轻，并出现多食多饮多尿现象。随着实验进展，用药组大鼠体重逐渐增加，多食多饮多尿现象缓解，模型对照组及假手术组大鼠生活习性及体重无明显变化。

2.2 各组大鼠血糖、血脂、肾功能的变化

表2显示，大鼠8周给药结束后，血糖测定结果显示，模型组和治疗组与假手术组相比均差异显著(P＜0.01)，模型组与各治疗组之间无明显差异(P＞0.05)。各组大鼠血TC、TG未见统计学差异。模型组血 BUN、Cr高于假手术组(P＜0.01)，用药组较模型组有所下降(P＜0.05)，中药联合缬沙坦作用明显优于单用缬沙坦(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠 24h尿白蛋白、TGF-β1、PAI-1的变化

表1 各组大鼠体重及不同阶段摄食量饮水量变化表(珋x±s)

表2 各组大鼠血糖、血脂、肾功能的比较(珋x±s)

表3显示，模型组大鼠尿中白蛋白含量明显高于假手术组(P＜0.01)，2个给药组均能够抑制白蛋白的排出，其差异有统计学意义(P＜0.01)，其中，中药联合缬沙坦组的作用优于单用缬沙坦组(P＜0.05)。与假手术组相比，模型组 TGF-β1、PAI-1明显增高，其结果具有统计学意义(P＜0.01)。各治疗组与模型组相比，均显示出了对TGF-β1、PAI-1分泌的抑制作用(P＜0.01)，消渴益肾方组的作用优于缬沙坦组(P＜0.05)。

表3 各组大鼠24h尿蛋白、TGF-β1、PAI-1的比较(珋x±s)

3 讨论

糖尿病可通过多条途径促使糖尿病肾病的形成，每条途径既可单独致病，又可通过影响其他途径致病，各途径之间常可相互促进，并在致病过程中产生协同作用。在整个实验期间，大鼠血糖持续保持在较高水平，尿白蛋白排出，血 BUN、Cr均显著增加，证实切除糖尿病大鼠一侧肾脏能够造成对侧肾脏的高灌注和高滤过，能显著加重糖尿病肾脏病变。

中医学认为，糖尿病肾病的病机关键为气阴两虚、脾肾双亏、水瘀内阻，故治疗上以标本兼治为原则，以健脾益气、补益肝肾、活血利水为治疗大法。方中黄芪、茯苓、白术益气健脾;山药补脾，又能益肾固精，止漏浊;山茱萸补肝肾涩精止遗;熟地、枸杞子滋补肾阴;泽兰、水蛭活血利水;诸药合用恰合糖尿病肾病的病机。药理研究显示，黄芪、茯苓、白术［3］有利尿消肿作用，黄芪［4］通过调节肾小球疾病蛋白质代谢紊乱，提高血浆白蛋白水平，降低尿蛋白;茯苓［5］的主要活性成分是茯苓素，可竞争醛固酮受体，体内逆转醛固酮效应，有利于水肿患者尿液的排出，恢复肾功能，消除尿蛋白;山药［3］能恢复肾功能，减少蛋白尿;熟地黄［6］中的地黄寡糖能够降低血糖，改善糖脂代谢;枸杞子［3］的主要成分是枸杞多糖，能够增强免疫力，降低血糖;泽兰［7］、水蛭［3］、山茱萸［3］能抑制血小板聚集，抗血栓形成，对糖尿病肾病起到改善循环的作用，诸药联用，共同发挥肾脏保护作用。

蛋白尿为DN的一个显著特征，因此蛋白尿能否下降也成为观察药物对DN疗效的敏感指标。本实验中，DN模型大鼠尿白蛋白排出量的增加明显高于正常组，2个给药组均能够抑制尿白蛋白的排出，其中消渴益肾方组的作用明显优于单用缬沙坦组。

实验结果显示，模型组BUN、Cr均高于正常组，用药治疗后均有所下降，消渴益肾方组下降更为明显(P＜0.05)，说明消渴益肾方通过降低 BUN、Cr水平，改善肾功能，起到保护肾脏作用。

在DN的发病机制中，细胞因子被认为起着非常重要的作用，其中，TGF-β1的作用日益受到重视，有人认为，它是各种肾脏损伤因素的共同中介物，是肾小球硬化过程中细胞因子紊乱的核心［8］，它介导肾小球肥大及细胞外基质的堆积，直接参与DN的病理发生。在本实验中发现，与假手术组相比，模型大鼠血清 TGF-β1有明显升高，各治疗组对 TGF-β1的分泌具有抑制作用，中药干预组更加明显，提示2个药物可能通过不同的通路抑制 TGF-β1高表达，表现出协同作用，从而发挥更好的肾脏保护作用。PAI-1的沉积参与了肾小球病变的发展过程和肾小球硬化的发生机制。在我们的研究中发现，DN模型组大鼠血清PAI-1活性升高，导致纤溶活性降低，应用消渴益肾方、缬沙坦治疗可以降低血清中PAI-1的含量，2个药物联合应用效果更好。

综上所述，消渴益肾方能够通过多种途径改善肾功能，降低蛋白尿，延缓肾小球硬化，发挥肾脏保护作用。

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