肽酰基精氨酸脱亚胺酶4基因多态性与类风湿性关节炎及抗环瓜氨酸化蛋白抗体的相关性研究*

崔刘福，袁 伟，杨文浩，舒 荣，宋海澄，韩依轩，于 萍，王 建，王洁蕊

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种累及周围关节为主的多系统性炎症性自身免疫病。它的一个显著特点就是血清中存在多种抗体，抗环瓜氨酸化肽(CCP)抗体的研究是近年来诊断RA的重大进展，其特异性明显优于类风湿因子(RF)，并可以与RF同时检测，提高RA的诊断率。很多研究表明，抗瓜氨酸化抗原肽可能参与了RA的发病，其产量可能影响RA局部炎症的发展。对蛋白质瓜氨酸化过程的研究发现，肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PADI)是瓜氨酸化抗原肽产生的主要因素，它主要负责将精氨酸残基转化为瓜氨酸。2003年，Suzuki等发现，PADI4基因多态性与 RA的易感性有关，PADI4的SNP变异可影响PADI转录物的稳定性，从而影响抗瓜氨酸化抗原肽抗体的水平，但随后在英国、法国、阿根廷和北美等国家和地区的研究并没有得出一致的结论。RA属于中医“痹证”范畴。国内学者发现，不同证型RA患者基因表达和抗-CCP抗体(anti cyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP)水平存在差异，提示不同基因差异可能与RA的中医证型有关。本研究选择河北地区134例RA患者和140例健康对照，分别检测了padi4_94位点的SNP和抗 CCP抗体滴度，以探讨 PADI基因在RA发病机制中的重要作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2007年10月至2009年10月在河北唐山开滦医院住院的134例病人作为病例组，诊断均符合1987年ACR制定的RA分类诊断标准，其中女性87例，年龄21岁 ～82岁，平均年龄51.31岁 ±13.56岁;男性47例，年龄18岁 ～80岁，平均年龄48.17岁±13.41岁，病程从6个月到20年。均排除系统性红斑狼疮、多发性肌炎/皮肌炎、系统性硬化等结缔组织病和脊柱关节病及感染、肿瘤等疾病。健康对照组为140例健康体检人员，女性101例，平均年龄53.63岁 ±13.77岁;男性39例，平均年龄51.72岁±11.87岁，2组间性别、年龄比较均无统计学差异。

1.2 方法

1.2.1 血标本的采集 对照组及病例组均清晨空腹8h后，取肘前静脉血3ml加2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，置－20℃保存血样。

1.2.2 DNA的提取 以酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，另取抗凝血4ml 3000p/min离心10min分离血清，取上层血清置EP管中－20℃保存。

1.2.3 引物设计 检索Genebank获得padi4_94位点(rs2240340)基因序列，设计引物序列，目的基因上游引物序列为:5’-CCTCTGACCA CACCTG TTCC-3’;下游引物 5’-TCGAACCTCTCAT TGTGG TG-3’。

1.2.4 PCR-LDR方法检测SNP PCR扩增仪(PERKIN ELMER Gene Amp PCR system 9600)扩增基因组 DNA，反应体系为 20μl，含基因组 DNA1μl，d NTP2μl，引物各 0.4μl，1 × bμffer2μl，Mg2+2.4μl，TaqDNA聚合酶 0.2μl。反应参数为:95℃预变性15min，94℃ 变 性 30s，60℃ 退 火 90s，72℃ 延 伸 1 min，35次循环，72℃延伸7 min。3%的琼脂糖凝胶电泳检测，观察PCR产物的效果，PCR反应结束后，在LDR仪(PE9600)进行PCR产物的连接酶检测反应，LDR反应体系为 10μl，含位点特异性探针 1μl，PCR 产物≥1μl，LDR 反应 bμffer 1μl，连接酶 0.05 μl(上海翼和公司)。LDR反应参数为:95℃预变性 2min，94℃30s，50℃ 2 min，35 次循环。然后对LDR产物进行测序仪(ABI 377)分析，并对测序仪结果做数据分析，得SNP位点基因型分型结果。

1.2.5 抗CCP抗体的检测 检测试剂盒购自英国(Axis-Shield Diagnostics Limited Anti-CCP ELISA)，严格按照操作说明书进行。

1.3 统计学分析

使用SPSS13.0软件进行统计学分析，卡方检验分析基因型和等位基因频率在RA组和健康对照组2组之间是否存在统计学上的差异，分别采用卡方检验和Mann-Whitney U检验比较不同等位基因与抗CCP抗体的相关性。

2 结果

2.1 padi4_94基因型与等位基因频率的分布

表1显示，RA病例组和健康对照组中padi4_94位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，表明样本具有群体代表性。各基因型频率分布在病例组与健康对照组间差异具有统计学意义(P=0.035)。在所有病例、对照人群中携带AG基因型者患RA的可能性是GG基因型的2.010倍(OR=2.010，95%CI=1.162 －3.476)，且携带 A等位基因与RA存在相关性(OR=1.434，95%CI=1.022-2.014，P=0.037)。

2.2 padi4_94位点A等位基因与RA患者中抗CCP抗体的相关性

表2显示，以5U/ml作为抗CCP抗体的诊断界点，比较携带RA易感等位基因A阳性组和阴性组中抗CCP抗体的阳性率，2组相比差异具有统计学意义(X2=7.688，P=0.006)，其中阳性组中抗CCP抗体的阳性率高于阴性组。A等位基因阳性组的抗CCP抗体滴度明显高于阴性组，差异具有统计学意义(P=0.023)。

表1 padi4_94位点基因型及等位基因频率在病例组和对照组中的分布

表2 抗CCP抗体阳性/阴性与A等位基因相关

3 讨论

RA的病因复杂，多基因和环境因素的共同作用诱发病理性自身免疫反应，导致RA的破坏性多关节炎和多种关节外炎症表现。抗瓜氨酸肽抗体(anti-CCP)是目前所发现的对RA特异性最高的抗体，而在抗瓜氨酸肽抗体形成中具有关键作用的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PADI)成为RA病因学研究的热点。日本学者 Suzuki等［1］研究发现，PADI4基因padi4_94位点SNP与RA有很强的相关性，且该位点SNP可影响PADI4酶的产量，这提示PADI基因与RA的密切相关性，因此我们选择 padi4_94位点作为研究对象，以探讨PADI4基因在RA发病机制中的重要作用，同时检测病例组的抗CCP抗体滴度，分析PADI4基因SNP与抗CCP抗体之间的相关性。

国内学者［2］对于 RA中医证候与抗 CCP抗体的相关性研究发现，不同证候的RA患者中以湿热阻络型抗-CCP抗体最高，提示中医分型具有分子水平的基础。同时多个研究［3、4］表明，RA不同证候间的基因表达谱存在差异，该差异与RA患者和正常人之间有所不同，也与RA患者稳定期和活动期之间的基因表达谱不同，提示RA中医证候分类学具有基因表达谱依据。因此，可影响功能基因表达的单核甘酸多态性也可能是中医证候分类学的基础。

目前认为，PADI4基因是抗CCP抗体形成的关节。PADI4作为PADI酶家族的一个亚型，都能将蛋白质肽链中的精氨酸残基催化转化为瓜氨酸残基。目前PADI4与RA的相关性已获得公认，其可能的机制是:PADI4mRNA在炎症过程中浸润到滑膜细胞的嗜中性粒细胞中迅速转录和翻译，进而PADI4酶将滑膜中的蛋白催化产生瓜氨酸肽。这种瓜氨酸化使自身表位发生改变，外周淋巴细胞可以识别瓜氨酸化的自身表位，一旦针对一个自身蛋白修饰位点的自身免疫建立起来，免疫系统将识别自身抗原隐蔽的抗原决定簇，使自身抗原不断受到新的攻击，疾病迁延不愈并不断加重。研究表明，在RA 滑液的巨噬细胞中有大量的表达［5］，Shi J 等［6］］的研究证明PADI4可以提高瓜氨酸化抗原肽的水平。这些研究证实了上述机制，且表明PADI4在类风湿关节炎患者抗瓜氨酸化抗原肽的形成中具有决定性的作用。

本研究结果显示，padi4_94SNP位点与RA易感性之间存在相关性，A等位基因可能为RA的易感基因，这与日本的报道相一致，其基因型分布也与日本人群的基因型分布结果类似。但是关于PADI4SNP位点与RA易感性之间的关系并未获得一致的结果，英国［7］、阿根廷［8］和一个法国［9］人群的研究提示了阴性结果。这些报道认为，PADI4基因SNP与RA无关，这可能与不同人群种族内的遗传异质性有关。但即使在欧洲人群中的研究［10］也存在阳性的结果，提示种族的影响并不是导致差异的主要原因。另外，RA是一种复杂的多基因遗传病，是由许多微小基因和环境因素共同作用导致的结果，在环境因素中，寒冷、潮湿、外伤等常为本病的诱发因素，因此PADI4基因只有在一定的环境因素下才可能对RA的发病存在易感性。由于各地区的环境因素不尽相同，因此可能导致不同地区的研究结果的不一致性。同时其他遗传基因的变异也可能影响 PADI4基因对 RA的易感性，对 RA易感的PADI4功能型单倍体可能被其他基因中的某等位基因修饰。含有精氨酸或瓜氨酸的肽链可与HLADRB1的8个变异体相互作用，其中 HLA-DRB1*0401变异体对瓜氨酸化肽的免疫亲和力最高，并激活CD4+T细胞，因此推测RA发病机制中 PADI4受到HLA-DRB1变异体的影响。多个研究结果提示，PADI4与HLA-DRB基因的连锁可能是其影响类风湿关节炎易感性之的原因［11～13］。但不同种族之间的HLA基因具有差异，这可能导致了结果的不一致性。

我们随后检测了病例组抗CCP抗体的滴度，并分析了PADI4基因SNP与抗CCP抗体之间的相关性。研究认为，无论是应用滴度的连续变量分析方法，还是根据诊断阈值判定的二分类变量分析方法，都发现两者之间存在相关性，携带RA易感等位基因A的患者抗CCP抗体的阳性率较高，且其抗CCP抗体的滴度相对较高，这与日本的研究一致。而我们的研究从DNA水平上验证了Suzuki的观点，这说明PADI4基因SNP影响基因表达，导致体内PADI4产生增多，进而导致蛋白质广泛瓜氨酸化。

本文结果表明，PADI4基因是与河北汉族人群RA发病相关的一个易感基因，且PADI4基因与瓜氨酸化肽相关性的研究结果，为探索RA的发病机制提供了理论依据和新线索。进一步分析PADI4基因多态性与不同中医证候型的类风湿关节炎关系，可能会发现更多中医分析的理论基础，为RA的治疗开辟新的途径。

［1］ Suzuki A，Yamada R，Chang X，et al.Functional haplotypes of PADI4， encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4，are associated with rheumatoid arthritis.Nat Genet 2003，34(4):395-402.

［2］ 乐惠荣，梁 昀，袁 惠.类风湿关节炎中医证型与抗环瓜氨酸肽抗体的相关研究［J］.湖北中医杂志，2008，30(10):18-19.

［3］ 吕 诚，肖 诚，赵韩华，等.寒热证候类风湿性关节炎患者外周血CD4+T淋巴细胞基因表达谱初步探索［J］.中国中医基础医学杂志，2006，12(2):130-134.

［4］ 肖 诚，吕 诚，赵林华，等.活动期和稳定期类风湿性关节炎寒热证候患者外周血cD4+T淋巴细胞基因表达谱探索［J］.中国中医药信息杂志，2006，13(3):14-17.

［5］ Chang X，Zhao Y，Sun S，et al:The expression of PADI4 in synovium of rheumatoid arthritis.Rheumatol Int，2009 Oct;29(12):1411-6.

［6］ Shi J，Sun X，Zhao Y，et al:Prevalence and significance of antibodies to citrullinated human papilloma virus-47 E2345-362 in rheumatoid arthritis.JAutoimmun，2008 Sep，31(2):131-5.

［7］ Burr ML，Naseem H，Hinks A，et al.PADI4 genotype is not associated with rheumatoid arthritis in a large UK Caucasian population.Ann Rheum Dis.2010 Apr;69(4):666-70.

［8］ Poór G，Nagy ZB，Schmidt Z，et al.Genetic background of anticyclic citrullinated peptide autoantibody production in Hungarian patients with rheumatoid arthritis.Ann N Y Acad Sci，2007 Sep，1110:23-32.

［9］ Caponi L，Petit-Teixeira E，Sebbag M，et al.A family based study shows no association between rheumatoid arthritis and the PADI4 gene in a white French population.Ann Rheum Dis，2005，64(4):587-593.

［10］ Gandjbakhch F， Fajardy I， Ferré B， et al. A functional haplotype of PADI4 gene in rheumatoid arthritis:positive correlation in a French population.J Rheumatol，2009 May，36(5):881-6.

［11］ Bang SY，Han TU，Choi CB，et al.Peptidyl arginine deiminase type IV (PADI4)haplotypes interact with shared epitope regardless of anti-cyclic citrullinated peptide antibody or erosive joint status in rheumatoid arthritis:a case control study.Arthritis Res Ther，2010，12(3):R115.

［12］ Tamai M，Kawakami A，Iwamoto N，et al.Contribution of anti-CCP antibodies， proximal interphalangeal joint involvement，HLA-DRB1 shared epitope，and PADI4 as risk factors for the development of rheumatoid arthritis in palindromic rheumatism.Scand J Rheumatol，2010 Aug，39(4):287-91.

［13］ Hoppe B， Häupl T， Egerer K， et al. Influence of peptidylarginine deiminase type 4 genotype and shared epitope on clinical characteristics and autoantibody profile of rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis.2009 Jun，68(6):898-903.