瓜氨酸化与类风湿关节炎

赵静，李鸿斌，王静

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性滑膜炎为主要病变的自身免疫性疾病，体内存在多种抗瓜氨酸肽抗体(anti-citrullinated peptide antibodies，ACPAs)[1]，RA除有关节症状外，还可以并发关节外症状。瓜氨酸化可以诱导机体产生APCAs，APCAs是RA诊断、预测病情进展和预后转归的重要指标。ACPAs在RA中作用于多种细胞，介导免疫损伤机制。有研究表明，吸烟、空气污染等环境因素可使肺上皮细胞发生瓜氨酸化[2]，提示蛋白瓜氨酸化是细胞内损伤的一个早期标记。研究证实瓜氨酸化与自噬、中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETosis)及凋亡相关，并参与RA的发病机制[3]。本文对其进行综述。

1 瓜氨酸化

瓜氨酸化是一种生理性转录后修饰，在依赖Ca+的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminase，PAD)催化下，使精氨酸转化为瓜氨酸。蛋白质修饰能形成新的表位，产生不同于自身抗原的新抗原，可促进抗原提呈细胞(APC)对新抗原的识别和表达，从而提高蛋白质的免疫原性。

1.1 瓜氨酸化对抗原性的改变

瓜氨酸化可对APC、T细胞和B细胞抗原识别产生影响，瓜氨酸化修饰可以使蛋白形成新的表位，瓜氨酸化抗原暴露增加，可促进APC对瓜氨酸化抗原的摄取和识别，在携带HLA-DR B1 SE的RA中T细胞和B细胞可以识别瓜氨酸化抗原[4]。RA中B细胞可作为APC，通过与B细胞表面受体结合识别瓜氨酸化抗原，促进T细胞分化成熟为记忆性T细胞，活化的T细胞可促进B细胞释放ACPAs。自身反应性B细胞膜表面ACPAs与瓜氨酸化特定抗原结合，可进一步促进B细胞产生各种致炎因子和ACPAs，对RA的病情进展起着至关重要的作用[5- 6]。此外，记忆型B细胞亚群表达RANKL，参与调节RA的骨稳态和生成破骨细胞。RA滑膜中有大量CD4+T细胞浸润，研究证实从RA中分离出的瓜氨酸特异性T细胞主要为Th1和Th17表型，Th1细胞激活巨噬细胞作为APC，释放干扰素-γ、白介素- 2(IL- 2)和TNF-α等促炎细胞因子。Th17细胞刺激RA滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)产生促炎细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶，还通过分泌IL-17促进血管滑膜翳生长和破骨细胞分化。Th17细胞与调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)的平衡对于维持免疫耐受至关重要[7]。Treg通过直接接触或分泌TGF-β、IL-10等细胞因子，抑制靶向T细胞或抑制APC的功能，从而抑制免疫应答[8]。研究证明，RA 患者Treg数量减少和功能缺失使Th17/Treg细胞失衡，导致效应性T细胞(Teff)过度活化促发过度免疫炎症[9-10]。瓜氨酸化抗原促进APC表达的HLA-DR B1 SE识别T细胞上T细胞受体，使T细胞活化，从而进一步活化B细胞，使其释放ACPAs参与RA的发病，激活的T细胞可促进破骨细胞活化，使其释放RANKL，参与RA骨质破坏，促进成纤维细胞活化，促进巨噬细胞释放各种细胞因子，参与RA的炎症反应。

1.2 瓜氨酸化自身抗原的致病性

瓜氨酸化蛋白和ACPAs可以诱导产生关节炎。瓜氨酸化丝集蛋白可促进RA单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)发生增殖，而未经瓜氨酸化修饰的丝集蛋白则不能引起RA PBMC发生增殖反应。瓜氨酸化蛋白和HLA-DR B1共同表位(shared epitope，SE)都是关节炎发病的必需因素，有研究表明，瓜氨酸化纤维蛋白原可诱发HLA-DRB1*0401转基因大鼠模型产生关节炎症状，使用未瓜氨酸化修饰的纤维蛋白原和瓜氨酸化纤维蛋白原均不能诱发无SE野生鼠产生关节炎症状[11]。肽酰基精氨酸脱亚胺酶拮抗剂可以减轻胶原诱导的RA大鼠模型关节炎症状，进一步说明了ACPAs和瓜氨酸化在RA中的致病性[12]。

1.3 肽酰基精氨酸脱亚胺酶

肽酰基精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminase，PAD)可催化精氨酸转化为瓜氨酸，需要Ca2+辅助活化。PAD有5个亚型，在不同组织中表达并具有不同的功能，其中PAD2和PAD4研究较多，PAD2主要表达于中枢神经系统、造血干细胞和巨噬细胞，是维持大脑可塑性所必需的，在多发性硬化症中表达增高[13]。PAD4主要表达于脾、分泌腺、嗜酸性细胞和中性粒细胞[14]，PAD4催化瓜氨酸化，可改变趋化因子的生理功能和中性粒细胞胞外诱捕(NETs)的形成，并可促进RA产生新的自身抗原，PAD4可能存在自主瓜氨酸化，对RA具有预测和诊断价值[15]。

1.4 抗瓜氨酸肽抗体

抗瓜氨酸肽抗体(anti-citrullinated peptide antibodies，ACPAs)是识别瓜氨酸化抗原而发生交叉反应的一类抗体。机体感染微生物后释放PAD酶会使局部组织蛋白发生瓜氨酸化修饰，局部修饰的瓜氨酸化蛋白会促使机体发生一系列免疫反应，它通过激活APC提呈抗原，进一步活化特异性T细胞和B细胞，产生大量ACPAs，产生的ACPAs可识别病原体修饰的瓜氨酸化蛋白和机体自身修饰的瓜氨酸蛋白，从而形成免疫复合物，激活炎症细胞释放炎症因子引起组织损伤。研究表明，绝大多数的RA患者血清中可检测到ACPAs[16]，ACPAs是RA的早期诊断标记物，并可用于预测病情进展。ACPAs的研究历程从Nienhuis等[17]首先发现了抗核周因子，证实其诊断RA具有较高的特异性，随后发现了抗角蛋白抗体、抗纤维蛋白原、波形蛋白、α烯醇化酶、抗环胍氨酸肽等抗体[18]，它们都属于ACPAs家族成员。van Beers等[19]发明了一个词组“瓜氨酸组”，是指整个瓜氨酸蛋白，在RA血清和滑膜液中共鉴定出53种。

目前临床应用最多的是抗环胍氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibodies，CCP)，抗CCP抗体检测试剂目前有3代，在临床应用中发挥着不同的作用。抗CCP 2抗体对于RA的诊断特异性更高，抗CCP 2抗体也可出现在自身免疫性肝病和肺结核中，靶抗原通常是非瓜氨酸化抗原肽。抗CCP 3抗体对于未分化炎性关节炎发展为RA以及类风湿因子阴性的RA预测价值更高[20]。抗CCP抗体被美国风湿病学会(ACR)列为RA的分类诊断标准之一[21]。研究证实，ACPAs可在RA关节炎症状出现的数年前即可检测到，并与疾病进展迅速和疾病低缓解率相关，ACPAs越多者，提示会发生更多的侵蚀性关节炎和关节外表现，也是关节影像学进展的独立预测因素[22- 24]。患者体内短期内出现较多ACPAs，提示其进展为RA的风险率增高，进一步说明RA存在瓜氨酸化表位识别扩展现象[25- 26]。综上所述，APCAs在RA 中具有诊断和预后判断，同时也具有致病作用。

2 瓜氨酸化的影响因素

2.1 遗传因素

RA的发病机制目前认为是遗传易感者在环境影响和免疫机制等多种因素相互作用共同导致RA，RA易感者常携带HLA-DR B1*0401、*0404等位基因型，其抗原结合的主要序列是位于其β链第70- 74位的共同表位(SE)，SE具有发展为RA的高风险，自身抗原与HLA-DR B1 SE结合，提呈给T细胞，进一步活化B细胞，产生ACPAs，参与RA的发病机制。HLA-DR B1 SE是ACPAs产生的危险因素，但不是RA进展的独立危险因素[20，27- 28]。

2.2 环境因素

吸烟可诱导产生瓜氨酸化蛋白。在吸烟合并间质性肺炎的RA患者的肺泡灌洗液发现有瓜氨酸化修饰的自身抗原[29]。吸烟和矽尘是RA的危险因素，也是携带HLA-DR B1 SE RA产生ACPAs的危险因素[30]。研究证实吸烟的RA患者疾病活动度评分更高，更容易出现关节外表现，并且关节破坏进展快、治疗反应差，也是预后不良的危险因素[31]。吸烟者PAD2表达升高，可导致肺组织瓜氨酸化抗原暴露增加，激活树突状细胞和B细胞，产生ACPAs[4]。

2.3 牙龈卟啉单胞菌

牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis，Pg)感染在RA中发挥作用。Pg是引起牙周炎(periodontitis，PD)的主要致病菌，其表达的PAD酶又称为PPAD，可引起微生物和宿主蛋白发生瓜氨酸化。PPAD不依赖Ca2+，需要在高PH值中活化，以肽结合或者游离形式存在[15]。PPAD催化产生的瓜氨酸蛋白与PAD催化的瓜氨酸蛋白具有高度的相似性，都可激活特异性T细胞，进而促进B细胞分化成熟，产生ACPAs。尽管PD和RA在病因学不同，前者是感染，后者是自身免疫，但两者可能具有相似的致病机理和对骨组织破坏的免疫学路径，两者均可促进释放促炎因子和基质金属蛋白酶及活性氧，从而引起关节周围组织和牙周组织的破坏及侵蚀[32]。Pg引起的关节炎很大程度上取决于Th17/Treg细胞失衡，可能是由TLR和IL-1引起的Th17活化，产生IL-17Ra信号传导，中性粒细胞浸润加重关节炎症，并导致局部关节破坏[4]。

3 瓜氨酸化对RA自身炎症的作用机制

RA患者细胞内、外瓜氨酸化蛋白积聚，是形成ACPAs的抗原驱动。ACPAs与瓜氨酸化抗原相互作用形成免疫复合物(ICs)，ICs与巨噬细胞的FcγR结合，激活巨噬细胞释放降解酶和活性氧，产生炎性细胞因子，参与RA的自身炎症过程。RA患者滑膜内形成的ICs和沉积在软骨表面的ICs是引起中性粒细胞活化和滑膜炎症的重要介质，中性粒细胞活化后产生脱颗粒，并释放降解酶及活性氧导致局部软骨和组织破坏。激活的可溶性受体和细胞因子以及滑膜细胞的活化、增殖和侵袭均参与RA关节的损伤。细胞活化释放的IL- 8和白三烯B4等趋化因子，在滑膜中可招募更多的中性粒细胞参与，进一步级联放大RA炎症过程。ACPAs与RA骨质破坏相关，表现为骨侵蚀发展更快，骨皮质和骨小梁的结构变化更为显著。在RA中，ACPAs通过激活经典途径和替代途径活化补体，与补体共同作用发挥免疫募集效应，促使趋化炎性细胞、增加血管通透性、促进吞噬作用以及释放促炎性细胞因子和趋化因子，这一过程不仅可导致组织损伤，而且进一步促进瓜氨酸化[33- 34]。在环境因素作用下，组织细胞异常的细胞死亡途径如自噬、凋亡和NETosis又进一步增加了瓜氨酸化抗原的暴露[35]。

4 瓜氨酸化与细胞死亡

真核细胞生理过程中发生的凋亡、自噬、NETosis都涉及到瓜氨酸化。瓜氨酸化通常发生在正在凋亡的细胞，凋亡细胞Ca2+内流激活PAD酶，催化肽基精氨酸修饰转变为肽基瓜氨酸，导致细胞蛋白发生降解，形成的凋亡小体被巨噬细胞吞噬。凋亡的异常调节或者凋亡物质的无效清除会导致死亡细胞聚集和细胞核抗原暴露，从而更容易打破自我耐受，RA滑膜细胞受损形成的凋亡是产生炎症过程中的关键点[36]。生理情况下存在自噬，生长因子缺乏或细胞衰老等病理情况下，机体通过自我吞噬导致细胞死亡，自噬参与RA瓜氨酸化过程中APC的提呈。

NET产生的过程，称为NETosis，是细胞内死亡的特定过程，它与坏死和凋亡不同，细菌、活化的血小板、脂多糖、佛波脂、真菌等刺激物都可诱导细胞产生NET，NET富含抗微生物分子，具有捕杀细菌、病毒、真菌和寄生虫等防御作用，也可产生导致组织损伤的病理作用。瓜氨酸化对于NETosis是必不可少的，参与RA中NET的形成，RA患者的中心粒细胞更容易形成NETs，并且在RA的滑膜液中发现了瓜氨酸化组蛋白[37- 38]。NET参与RA发病机制主要体现几个方面，其一是NET可能是体内新抗原的重要来源和自身抗原被修饰的场所，包括瓜氨酸化自身抗原。其二是NETosis过于旺盛和NET清除障碍，被修饰的自身抗原清除延迟，持续性刺激产生免疫炎症，从而使疾病慢性化[39]。其三是NET的中性粒细胞胞内颗粒成分包括中性粒细胞趋化因子、细胞因子及蛋白酶以非特异性形式产生免疫损伤[40- 41]。

5 瓜氨酸化对RA非免疫细胞的作用

FLS和破骨细胞是参与RA发病机制的重要细胞，FLS是RA中最常见的血管翳-软骨连接处的细胞，通过产生细胞因子、趋化因子和基质降解分子，迁移和侵袭关节软骨，导致关节破坏。研究报道，瓜氨酸波形蛋白或纤连蛋白可抑制RA FLS细胞凋亡，促进促炎细胞因子分泌[42]。ACPAs与FLS表面瓜氨酸抗原相互作用通过磷酸肌醇3激酶介导机制促进FLS迁移[43]。破骨细胞在RANKL和M-CSF诱导下从单核巨噬细胞谱系分化而来，是RA发生骨破坏的主要机制。ACPAs可以直接诱导破骨细胞分化，TNF-α也是诱导破骨细胞分化和骨吸收的重要因子。ACPAs与FLS和破骨细胞表面瓜氨酸抗原相互作用会促进FLS迁移和增加破骨细胞分化[42]，体内存在的RF会进一步增强ACPAs相关的破骨细胞活化作用。

综上所述，遗传、环境和免疫等多因素相互作用共同导致RA，瓜氨酸化修饰在RA中具有潜在的致病作用，瓜氨酸化修饰可以使蛋白形成新的表位，可促进APC对瓜氨酸化抗原的摄取和识别，活化T细胞、促使B细胞成熟释放ACPAs。ACPAs在体内作用于多种细胞介导免疫机制参与RA的发病，ACPAs是RA诊断、预测和转归的重要指标。瓜氨酸化在炎症组织中广泛存在，并与凋亡、自噬和NETosis过程相关，在RA发病机制中起重要作用。