止喘汤对哮喘大鼠模型气道重构中MMP-9、TIMP-1表达的影响*

霍博雅，张占锋

哮喘是严重影响人体健康的慢性呼吸道炎症性疾病，其临床特点是慢性进行性和难以根治性。气道重构是气道炎症反复损伤和修复的结果，是造成哮喘患者不可逆气道阻塞的重要原因［1］。目前，对于哮喘气道重构仍缺乏有效的治疗方法。通过对哮喘大鼠模型气道重构的动态观察发现，基质金属蛋白酶-9/基质金属蛋白酶抑制剂-9(MMP-9/TIMP-1)比例可以作为一种显示哮喘气道组织破坏和修复之间平衡的标志，采取措施抑制MMP-9的过度表达，调节MMP-9/TIMP-1的平衡可以干预气道重构［2］。本实验用大鼠哮喘模型观察中药对气道壁结构及MMP-9、TIMP-1表达的影响，探讨中药复方在哮喘气道壁重构中的作用、可能的机制以及存在的优势。

1 材料与方法

1.1 动物及主要试剂、仪器

8周龄SPF级雄性SD大鼠50只，体重200g±20g，由辽宁医学院实验动物中心提供。主要试剂和药品:卵清白蛋白(GradeIII OVA，sigmaA5378)，MMP-9、TIMP-1、IV型胶原多克隆抗体、SP试剂盒、DAB试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。黄芩和止喘汤:各取生药500g，分别加8倍量的水，各提取2次，每次1h，过滤，常压浓缩至500ml(辽宁医学院三附院中药制剂室)。西药:BUD气雾剂(阿斯利康制药有限公司，批号国药准字H20030410，规格5ml:20mg)。JWC–201D超声雾化器(辽宁鞍山市同信医用仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 分组 将上述大鼠置于辽宁医学院基础医学院标准动物实验室内分笼饲养，自由饮水和进食，观察 7d，所有大鼠反应正常，把大鼠随机分为正常组、哮喘组、BUD组、黄芩组和止喘汤组5组，每组10只。

1.2.2 哮喘动物模型的复制 参照Holgate等［1］的方法复制大鼠慢性哮喘模型。第1、8天腹腔注射10%的 OVA混悬液 1ml［内含 OVA100mg、AL(OH)3100mg］致敏，自15d始分别将各组大鼠置于30×30×40cm有进出两口的有机玻璃箱内，1%OVA溶液雾化吸入，0.5ml/min，30min/次，1 次/d，共 6 周。中药组:每次激发前30min中药灌胃(按大鼠体质量1ml/100g);BUD组:激发前30min生理盐水灌胃及5ml:1mgBUD雾化吸入;哮喘组激发前30min生理盐水灌胃;正常组腹腔注射、灌胃及雾化吸入以生理盐水代替。以大鼠呼吸急促、口唇发绀、点头呼吸及站立不稳等表现为模型建立成功的标志。

1.2.3 取材及测定方法 各组动物均于最后1次激发24h内处死并收集肺组织标本。取右肺中叶肺组织标本4%的多聚甲醛固定后，进行脱水、透明、垂直于气道取材，石蜡包埋、切片、片厚 4μm。一部分切片按HE常规染色步骤染色。另一部分切片作免疫组化处理:采用SP法并严格按照试剂盒说明书进行操作，采用微波抗原修复，各组分别滴加1∶200的一抗，阴性对照以PBS代替一抗，其余条件相同。染色判断标准:阴性为不着色，弱阳性呈淡黄色，阳性呈黄色，强阳性呈棕黄色和棕色。

1.2.4 气道形态学参数测量及免疫组化半定量分析 气道形态学参数测量:每组随机抽取10张切片，每张切片选取3支直径为200μm左右完整无斜切的小支气管，参照文献［3］关于气道各层的定义，采用病理图像分析系统测定各支气管基底膜周径(Pbm)、外壁面积(WAo)、内壁面积(WAi)及气道平滑肌面积 (WAm)，并用 Pbm将测量值标准化，以消除管径大小、气道状态以及切片方向不同等所造成的差别，分别以 WAo/Pbm、WAi/Pbm、WAm/Pbm表示相应管壁层的厚度。免疫组化半定量分析:随机取10个视野，采用计算机图像处理软件测定各组气道壁 MMP-9、TIMP-1、IV型胶原含量(免疫组织化学染色阳性单位)。

1.3 统计学处理

所有计量资料以珋x±s表示，用SPSS17.0统计软件对统计结果进行分析，各计量数据先进行正态检验和方差齐性检验，凡符合正态分布和方差齐性的数据，采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD法。对不符合正态分布和方差齐性的计量数据，则进行秩和检验(Kruskal– Wallis法)，多组间两两比较采用 Mann–Whitney U法。相关性分析采用Pearson法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理形态学观察结果

表1显示，正常组支气管、肺组织结构正常，各级支气管上皮完整，肺泡间隔正常，无明显炎性细胞浸润。哮喘组气道黏膜水肿，黏膜皱襞增多，黏膜下及管周有大量的炎性细胞浸润，气道上皮细胞脱落，杯状细胞增多，细支气管的气道壁、平滑肌层及基底膜等明显增厚，管腔变窄甚至闭塞。中药组和BUD组较哮喘组上述改变明显减轻。

表1 各组大鼠气道形态学指标比较(珋x±s，n=10)

2.2 免疫组织化学染色结果

表2图1显示，正常组气道黏膜上皮细胞、少量的间质细胞及极少量的炎性细胞有微量的MMP-9及TIMP-1表达;模型组气道上皮细胞、气道炎性细胞及气道外壁的成纤维细胞和间质细胞均有表达，部分棕黄色呈强阳性表达;中药组和BUD组较哮喘组颜色变浅，表达明显减弱。IV型胶原在气道壁上的表达情况与MMP-9及TIMP的表达趋势相同。

表2 各组大鼠气道MMP-9、TIMP-1及IV型胶原表达比较(珋x±s，n=10)

3.3 各组大鼠气道壁厚度、IV型胶原与MMP-9、TIMP-1的相关性分析

大鼠气道形态学各指标及IV型胶原含量与MMP-9、TIMP-1呈正相关，与 MMP-9/TIMP-1呈负相关。

3 讨论

细胞外基质(ECM)的降解和沉积失衡是导致呼吸道壁结构异常构建、肺实质破坏及间质增生的重要原因，而MMP则是调节ECM代谢的主要限速酶。气道重构的过程也是MMP在气道壁沉积的过程，MMPs和TIMPs的平衡是维持ECM内环境稳定的决定因素。国内外研究发现，在MMPs中，MMP-9和 TIMP-1与哮喘气道壁重构有密切关系［2、4］。

图1

哮喘气道重构是哮喘气道结构改变的简称，在形态上主要表现为气道壁增厚、上皮细胞损伤、基底膜网状层增厚、黏膜下胶原沉积、支气管平滑肌增生、血管增生及外膜新血管形成［5］。气道重构在哮喘的早期或轻型哮喘即存在，并有研究认为它是哮喘发病过程中的一个原发的病理表现［6］。气道重构导致气道高反应性、促进气道炎症的持续、产生糖皮质激素抵抗及恶化肺功能，有学者认为它可能是顽固性哮喘的病理学基础［7］。气道重构一旦发生即难以逆转，目前认为激素对上皮下纤维化有一定作用，但随着激素抵抗性哮喘增多，激素加重哮喘气道重构被报道［8］以及激素的全身副作用被重视，激素的应用面临挑战。

中医认为，哮喘的基本病机是本虚标实证(宿痰内伏、外邪触发，肺脾肾虚是疾病的关键)，止喘汤(党参、白术、茯苓、甘草、桑白皮、杏仁、葶苈子、黄芩、丹参、川芎)是基于哮喘基本病机证型的复方，由定喘汤合四君子汤加减而成。全方具有补益肺脾肾、活血化瘀、清泄肺热、祛痰止咳平喘功效，为根据多年临床经验研制的自拟中药合剂，临床应用效果良好［9］。方中黄芩经实验研究证实，对哮喘气道炎症、气道高反性［5］和气道重构［10］有可靠作用。本实验病理形态学观察中药、BUD组均具有干预气道重构的作用，其中复方组肺纤维化程度要轻于单味组。各组MMP-9、TIMP-1的表达不同，高表达者气道壁增厚明显，且MMP-9、TIMP-1的表达及MMP-9/TIMP-1比值与IV型胶原表达、气道壁厚度之间密切相关。表明中药、BUD组可能通过抑制MMP-9、TIMP-1的过度表达，调节 MMP-9/TIMP-1的平衡而干预哮喘气道重构。本实验研究结果证实，中药具有干预哮喘大鼠模型气道重构的作用，这些作用可能是通过抑制MMP-9、TIMP-1的过度表达、调节MMP-9/TIMP-1的平衡而实现的。在疗效上基于中医基本病机证型的复方优于单味中药，此结果为复方治疗哮喘的中医辨证论治提供了现代实验室理论依据。

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