流动相pH值对地西泮、艾司唑仑、氯氮卓、三唑仑HPLC色谱行为的影响*

王蔚昕，张春水，黄 星

（公安部物证鉴定中心，北京 100038）

地西泮、艾司唑仑、氯氮卓、三唑仑属于苯二氮卓类药物，具备抗焦虑、催眠、抗痉挛等广泛卓越的药理特性和良好的安全性，但同时长期服用此类药物也会产生依赖性，导致该类药物的滥用现象[1]。地西泮、艾司唑仑、氯氮卓、三唑仑都为我国精神药品品种目录收载药品，受国家管制，但截至目前，在法庭科学领域还缺乏对4种药物高效液相分析方法的系统研究。本实验综合考察了流动相PH值对苯二氮卓类药物HPLC色谱行为的影响，以期通过基础性数据的积累，为苯二氮卓类药物高效液相方法的开发提供参考依据。

1 实验部分

1.1 试剂与标准品

地西泮、艾司唑仑、三唑仑、氯氮卓标准品；0.1M磷酸缓冲液（H3PO4、NaH2PO4、Na2HPO4）；乙腈。

1.2 主要仪器及实验条件

日本岛津LC20AD液相色谱仪；SPD-M20A二极管阵列检测器；CTO-20A柱温箱；SIL-20A自动进样器；LCsolution高效液相色谱管理系统。

色谱柱为 inertsil ODS-SP 5μ4.6×150mm（pH适用范围为PH2～7.5），柱温为40℃，流动相组成：有机相为乙腈、水相为0.1M磷酸缓冲液，洗脱程序为有机相、水相比例由25∶75经20min梯度洗脱至45∶55，并在此比例上维持 5min，流速 1.0mL·min-1，进样量1μL，舒乐安定、三唑仑检测波长为220nm，安定检测波长为230nm，氯氮卓检测波长为265nm。

1.3 实验操作

1.3.1 标准溶液的配制 称取地西泮、艾司唑仑、三唑仑、氯氮卓标准物质各适量，分别放入10mL容量瓶中，加入5mL甲醇振荡溶解后，用甲醇稀释至刻度，配制成约1.0mg·mL-1标准溶液。

1.3.2 缓冲溶液的配制

表1 缓冲溶液的配制Tab.1 Preparation of buffer solution

1.3.3 分析过程 分别以不同pH值0.1M磷酸缓冲液作为流动相的水相，取上述标准溶液在上述实验条件下进样分析，考察保留时间、拖尾因子、峰面积3个指标（每个样品相同条件下重复进样3次，各指标取平均值）。

2 结果与讨论

2.1 实验结果

表2 对地西泮各指标考察结果Tab.2 Index test result of Diazepam

表3 对艾司唑仑各指标考察结果Tab.3 Index test result of Estazolam

表4 对氯氮卓各指标考察结果Tab.4 Index test result of Chlordiazepoxide

表5 对三唑仑各指标考察结果Tab.5 Index test result of Triazolam

2.2 讨论与分析

图1 地西泮、艾司唑仑、氯氮卓、三唑仑保留时间随流动相水相pH值的变化Fig.1 Curve of pH-retention time

图2 地西泮、艾司唑仑、氯氮卓、三唑仑拖尾因子随流动相水相pH值的变化Fig.2 Curve of pH-tailing factor

图3 地西泮、艾司唑仑、氯氮卓、三唑仑峰面积随流动相水相pH值的变化Fig.3 Curve of pH-peak area

2.2.1 流动相pH值对地西泮、艾司唑仑、三唑仑、氯氮卓保留行为的影响 根据几种苯二氮卓类药物流动相pH值-HPLC保留时间变化曲线图推测，地西泮、艾司唑仑的pKa∈〔0.7，4.1〕；氯氮卓的pKa∈〔3.7，4.5〕；对于三唑仑，pKa≤0.7 或 pKa≥7.9。

在进一步建立液相方法时，如果需要通过调整谱峰间距改善分离度，在考虑色谱柱pH值适用范围的基础上，对于地西泮、艾司唑仑，流动相水相pH值应限定在pH值为2～3的范围内进行变化；对于氯氮卓，pH值可以在pH值为3～5的范围内进行变化；对于三唑仑，pH值在pH值为2～6的范围内进行变化对其保留时间基本无影响。

如果需要减小流动相pH值对保留行为的影响，保证方法的重现性、稳定性，在考虑色谱柱pH值适用范围的基础上，对于地西泮、艾司唑仑，流动相水相pH值应控制在5～7的范围；对于氯氮卓，pH值可控制在6～7或2～2.2的范围，在低pH值端其保留时间较高pH值端明显缩短，但低pH值端pH值稳定范围过窄，在实际应用中应综合考虑保留时间及操作稳定性两个因素，选择合适pH值范围；pH值在2～7的范围内，三唑仑的保留行为都较为稳定。

2.2.2 流动相pH值对地西泮、艾司唑仑、三唑仑、氯氮卓峰形的影响 流动相水相pH值控制在2.2～6.4的范围内，地西泮、艾司唑仑、三唑仑都能得到较好峰形，且其拖尾因子值基本不随pH值的改变而变化。

流动相pH值的改变对氯氮卓的峰形影响较大，在pH值小于3.2时，氯氮卓成分峰形较差；pH值控制在3.2～6.4的范围内，氯氮卓也可得到较好峰形，且拖尾因子值基本稳定。峰形不好可能导致理论塔板数测定不准确，分离度降低，定量不准确[2]。因此，氯氮卓HPLC定量分析方法的开发不适合在流动相水相pH值2～3的范围内进行。

2.2.3 流动相pH值对地西泮、艾司唑仑、三唑仑、氯氮卓DAD检测器响应值的影响 在流动相水相pH值为2.2～3.2的范围内，地西泮、艾司唑仑、氯氮卓的单位响应值随pH值增大而增大，氯氮卓单位响应值变化尤为明显；在流动相水相pH值为5.6～6.4的范围内，地西泮、艾司唑仑、氯氮卓的单位响应值基本不随pH值的改变而变化，稳定保持在较高值。

在流动相水相pH值为2.2～6.4的范围内，三唑仑的单位响应值不随pH值的改变而变化，保持稳定。

待检药物单位响应值的高低对其检测限有较大影响，且其单位响应值的稳定性也显著影响实验数据的长期可比性。为了降低苯二氮卓类药物的检测限，提高检测数据长期可比性，苯二氮卓类药物HPLC分析方法应该在流动相水相pH值为5～7的范围内进一步开发。

［1］童振华,徐嗣荪.苯二氮卓类药物依赖［J］.中国民政医学杂志,1995,7（5）:298-300.

［2］L.R.森德尔,J.J.柯克兰,J.L.格莱吉克.实用高效液相色谱法的建立［M］.北京：华文出版社,2001.221-222.