高浓度 D-葡萄糖对早孕绒毛细胞滋养细胞TNF-α、IL-6表达的影响

黄俊花,李 栋,刘 媛＊

(1章丘市妇幼保健院,山东章丘 250200;2山东大学齐鲁医院)

妊娠期糖尿病(GDM)可导致多种孕期并发症,并且是导致孕晚期胎死宫内、新生儿呼吸窘迫综合症的重要病因。GDM胎盘功能异常是多种孕期并发症的原因。目前研究[1]认为,炎症因子的过度表达可能是导致胎盘功能异常的主要原因。既往对脐带内皮细胞和肾小球内皮细胞的研究发现,高糖可以诱导其表达高浓度炎性因子,从而影响细胞功能。本研究选取正常早孕绒毛细胞滋养细胞进行原代培养,通过培养液中加入不同浓度 D-葡萄糖,模拟正常妊娠和GDM血糖水平,同时设立甘露醇作为渗透压对照组,以排除渗透压改变可能对细胞功能的影响,观察高糖对早孕绒毛细胞滋养细胞功能的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究选取 2009年 4～7月在山东大学齐鲁医院妇产科门诊接受人工流产的早孕(孕周为 8～10周)妇女的正常绒毛。孕妇平均年龄 29岁,无任何内外科并发症。

1.2 细胞滋养细胞的分离纯化与培养 新鲜绒毛组织用 PBS冲洗 3～5次,去除膜状物后剪碎。将碎块用0.25%的胰酶37℃温箱振荡消化20 min, 200目筛网过滤,2 000 r/min离心10 min弃上清, PBS重悬。配制30%和60%浓度Percoll分离液,按照浓度大小加入15ml离心管中,将细胞悬液小心加到Percoll分离液液面上,2 000 r/min离心20 min,取中间白膜层细胞,PBS洗2次,细胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬放入培养瓶中。将培养瓶放入5%CO2、37℃温箱中培养。1.3 细胞滋养细胞的鉴定 将 2块细胞爬片用4%的多聚甲醛4℃固定1 h,PBS洗 3次,1%的H2O2室温孵育3min,PBS洗3次。10%的胎牛血清室温封闭10min,弃胎牛血清,勿洗。分别加一抗CK-7及波形蛋白(VIM)37℃湿盒内孵育1 h。PBS洗3次后加二抗,37℃湿盒内孵育1 h。PBS清洗后DAB显色,显微镜观察显色情况。

1.4 细胞滋养细胞培养 将培养细胞随机分为A、B、C、D四组,A组为空白对照,B组加入正常浓度D-葡萄糖,C组加入高浓度 D-葡萄糖,D组加入甘露醇。四组分别培养 72 h,计数细胞数目。

1.5 培养液中TNF-α及IL-6测定 所有培养孔板均培养 72 h后,离心分离上清液和细胞,上清液中TNF-α及IL-6测定用ELISA法,操作严格按照说明书进行。预实验结果显示,检测IL-6时样品稀释10倍效果最佳,而检测 TNF-α时样品无需稀释。在全自动酶标仪450 nm波长处检测各组吸光度(A)值,利用标准曲线求出浓度。实验重复 3次,取均值。

1.6 细胞TNF-α、IL-6 mRNA检测 采用RT-PCR法。Trizol试剂一步法提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度。取1μg总RNA按照反转录试剂盒说明操作,获得cDNA。采用ABI 7500 PCR系统及SYBR green I染料法进行PCR。以GAPDH作为内参照。PCR条件：95℃10 min,95℃15 s,63℃1 min,共 40个循环。为确定扩增产物的特异性,每个样品均设复孔以减少操作误差。采用2-ΔCT法比较基因表达,其中 ΔCT=CT目的基因-CT内参基因。整体实验至少重复 3次。所得数据通过Sequence Detection Software 1.4软件进行统计分析。

2 结果

细胞培养上清液中TNF-α及IL-6检测结果见表1。培养细胞中TNF-α、IL-6 mRNA检测结果比较见表2。

表1 各组细胞培养液中TNF-α及IL-6水平比较(pg/m l,±s)

表1 各组细胞培养液中TNF-α及IL-6水平比较(pg/m l,±s)

注：与A、B、D组相比,＊P＜0.05

组别 TNF-α IL-6 A组 175.39±50.62 608.35±93.26 B组 179.32±51.23 615.21±98.24 C组 416.12±38.29＊ 1316.45±185.36＊D组 162.45±48.36 579.62±87.64

表2 各组细胞滋养细胞TNF-α及IL-6m RNA表达比较(中位数)

3 讨论

对GDM的研究发现,胰岛素敏感性降低、胰岛素抵抗诱发的糖代谢异常是导致母体及胎儿不良结局的重要因素[2]。既往对足月妊娠胎盘组织的研究发现,GDM患者胎盘组织中TNF-α及IL-6表达明显增加,胎盘滋养细胞凋亡明显增加,但导致胎盘TNF-α及IL-6表达增加的原因并不明确[3]。本研究证实,高糖可以诱导细胞滋养细胞对TNF-α及IL-6的表达。

TNF-α及IL-6是炎症介导内皮细胞损伤的重要因子,同时诱导细胞凋亡的发生。高糖诱导的炎症因子表达的增加可以造成胎盘细胞凋亡增加,血管内皮损伤,影响早孕期细胞滋养细胞对子宫内膜的侵袭及螺旋动脉的形成,导致胎盘功能异常。

孕期胎盘自身产生的TNF-α、孕激素、胎盘泌乳素等均参与孕期胰岛素抵抗。对许多妊娠并发症的研究发现,在子痫前期、早产、习惯性流产等情况下,胎盘组织中TNF-α高表达。有学者认为胎盘过度表达TNF-α导致的细胞滋养细胞侵袭异常是引起上述疾病的原因[4,5]。由于 TNF-α可以下调脂肪细胞、肝细胞、肌肉细胞中胰岛素受体数量,可以加剧孕期胰岛素抵抗的程度,当其高表达时,可导致GDM发生。TNF-α诱导胎盘滋养细胞的凋亡,影响胎盘功能,可能是导致GDM孕妇孕期胎儿异常的重要原因。本研究也证明,高糖情况下,滋养细胞过度产生 TNF-α,从细胞学水平证实高糖可以诱导TNF-α过表达,从而导致胰岛素依赖加重,并诱发GDM。

[1]Hill JA,Choi BC.Maternal immunological aspects of pregnancy success and failure[J].JReprod Fertil,2000,55(Suppl 2)：91-97.

[2]Kirwan JP,Hauguel-De Mouzon S,Lepercq J,et al.TNF-αis a predictor of insulin resistance in human pregnancy[J].Diabetes, 2002,51(7)：2207-2213.

[3]Nelson SM,Coan PM,Burton GJ,et al.Placental structure in type 1 diabetes：relation to fetal insulin,leptin,and IGF-I[J].Diabetes,2009,58(11)：2634-2641.

[4]Gucer F,Balkanli-Kaplan P,Yuksel M,et al.Maternal serum tumor necrosis factor-in patients with preterm labor[J].JReprod Med,2001,46(3)：232-236.

[5]Yui J,Garcia-Lloret M,Wegmann TG,et al.Cytotoxicity of tumour necrosis factor-and-interferon against primary human placental trophoblasts[J].Placenta,1994,15(8)：819-835.