大蒜素对人肺癌 H460细胞增殖及凋亡的影响

杜亚明,郑 伟,王中彬＊,刘长军,苏 鹏

(1辽宁医学院附属第一医院,辽宁锦州 121001;2武警辽宁省总队医院; 3鞍山市第二医院;4辽阳市中心医院)

大蒜素具有抗癌、防癌作用[1]。目前,有关大蒜素在消化道肿瘤中的作用研究较多,而在肺癌中的作用研究较少。2010年 4～10月,我们观察了大蒜素对人肺癌 H460细胞增殖及凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 H460细胞。大蒜素注射液(12 mg /ml)配制成100 mmol/L的溶液,0℃避光保存; RPMI1640培养液,胰蛋白酶,胎牛血清(FBS),吖啶橙试剂(AO),MTT,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒。TEHER二氧化碳孵箱,TDGC-2J-1超净工作台,Olympus倒置显微镜和荧光显微镜,流式细胞仪,TGL-16G高速冷冻离心机,G3022酶联免疫检测仪,DHG-9030A数显气浴恒温干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H460细胞在完全培养基中培养,2 d换液 1次,至细胞处于对数生长期、长满培养瓶底面积约80%;用0.25%胰蛋白酶消化传代,按105/m l接种于 50m l培养瓶中。

1.2.2 大蒜素对 H460细胞增殖作用观察 采用MTT法。取对数生长期的H460细胞,以1×104/ml接种于96孔板,100μl/孔,置 37℃、5%CO2的培养箱内过夜(6～12 h)。细胞贴壁后,实验组分别加入12.5、25、50、100μmol/L的大蒜素,并分别培养24、48、72 h,每个浓度、每个时点均设 4个复孔,对照组设1个复孔。终止培养前4 h,每孔加入MTT溶液20μl,继续培养;终止时吸弃上清液,每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO),微孔板震荡器上震荡10min,用酶标仪于570 nm处测定各孔吸光度值(OD值)。细胞增殖率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3 大蒜素对 H460细胞凋亡作用观察 取对数生长期的 H460细胞,以 5×105/m l接种于 6孔板,2 ml/孔。分别加入0、12.5、25、50、100μmol/L的大蒜素作用24 h,离心后,收集H460细胞;PBS洗涤3次,加入碘化丙啶(PI),避光染色15 min,上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件。数据比较用方差分析和 q检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜素对H460细胞增殖的影响 见表 1。由表 1可见,随着大蒜素浓度增大、作用时间延长, H460细胞增殖率逐渐降低,呈剂量、时间依赖性(P均＜0.05)。

表1 实验组不同浓度大蒜素对H 460细胞增殖的影响(±s)

表1 实验组不同浓度大蒜素对H 460细胞增殖的影响(±s)

大蒜素浓度(μmol/L)细胞增殖率(%) 24 h 48 h 72 h 12.5 93.67±2.18 88.84±2.58 77.12±2.15 25 86.67±0.84 85.01±1.05 74.78±3.59 50 57.89±2.78 46.23±1.63 24.05±3.27 100 43.79±1.48 34.96±2.70 23.23±1.43

2.2 大蒜素对 H460细胞凋亡的影响 大蒜素与H460细胞共培养 24 h后,其浓度为 0、12.5、25、50、100μmol/L时,H 460细胞凋亡率分别为 0.45% ±0.23%、8.54%±1.54%、12.43%±1.95%、29.47%±3.83%、38.69%±6.66%。随着大蒜素浓度增大,H460细胞凋亡率逐渐升高,呈一定剂量依赖性(P＜0.05)。

3 讨论

大蒜素是大蒜特有的含硫化合物,一般被用于抗细菌、病毒和真菌的感染。体外实验证实,大蒜素能够直接杀伤肿瘤细胞,或通过调节机体免疫功能干扰肿瘤细胞的生长等途径而抑制肿瘤发生,而且这种抑制作用对生物体几乎无不良反应。其抗肿瘤作用可能有以下机制：①阻断致癌物质的合成[1]：亚硝酸盐是合成强致癌物亚硝胺的前身物,大蒜可降低胃内亚硝酸盐含量,从而影响亚硝胺的合成,进而降低患胃癌的几率[2]。乙烯雌酚(DES)可使人或动物致癌,Green等[3]研究提示大蒜素可直接抑制DES的代谢,从而预防雌激素诱导的肿瘤的发生。②抗氧化作用：研究[4]证实,大蒜素能对抗毒物对机体的氧化性损伤,与其所含的巯基和亲电子集团具有清除活性氧自由基作用有关。Thomas等[5]研究证实,大蒜素中的有效成分二烯丙基硫醚(DAS)能有效抑制乳腺组织代谢中DES氧化所导致的细胞基因不稳定和癌变。③直接杀伤肿瘤细胞：哈敏文等[6]研究发现,大蒜素对胃癌 MGC-803、SGC-7901细胞的生长均有明显抑制作用,且呈剂量依性。④调节机体免疫功能：大蒜素作为一种免疫激发剂,能有效提高NK细胞活性和IL-2水平,增强T淋巴细胞分裂增生及活性[7]。⑤对抗肿瘤药物的增敏作用和抗耐药作用：研究[8]发现,适当调整抗癌药物和大蒜素的剂量,同时增加大蒜素给药次数,可能使大蒜素发挥很好的增敏作用。推测大蒜素与其他化疗药联合应用,可增强疗效,降低耐药性。

本研究结果显示,大蒜素在50～100μmol/L浓度范围内可显著抑制人肺癌 H460细胞的生长,而较低浓度(12.5～25μmol/L)的大蒜素对细胞的生长抑制不明显;随着大蒜素浓度的升高,H460细胞凋亡率逐渐升高。我们认为,一定浓度的大蒜素在体外对人肺癌 H460细胞有显著的生长抑制作用,与其细胞周期阻滞和细胞凋亡有关。当然,其确切机制及体内实验是否有类似结果,有待进一步研究。

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