植物原生质体全能性表达及其在甘蓝类蔬菜育种上的应用

盛小光 顾宏辉 赵振卿 虞慧芳 王建升 张晓辉

（浙江省农业科学院蔬菜研究所，浙江 杭州 310021）

植物原生质体一词始自 Hanstein（1880），即指通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分细胞物质。按照细胞全能性学说，离体的植物原生质体和其他起源的细胞一样，在合适的离体培养条件下，具有繁殖、分化、再生成完整植株的能力。它的出现有力地促进了与之相关领域科学研究的进程，其在基础研究及实际应用领域具显著优势。作为一种独特无壁的单细胞体系，并且同一时间内能得到遗传上同质的大量群体，为细胞生物学、发育生物学，甚至病毒学建立了试验体系；同时在体细胞杂交、体细胞无性系变异筛选、遗传转化、种质的超低温保存等方面具有广阔的应用前景。在农业应用尤其在作物品种改良方面，原生质体全能性的顺利表达是育种目的得以实现的关键和前提（赵大克 等，2009）。

Nagata和Takebe（1970）首次利用烟草叶片游离原生质体，经培养获得再生植株，使原生质体的研究和应用进入了一个新的阶段。尤其是有关培养过程中供试材料的诸多生理特性的研究，为原生质体培养提供了切实可行的理论依据，避免了培养过程中的盲目性，使原生质体培养技术日臻完善。目前，至少有46科160多属360多种植物（包括变种和亚种）的原生质体再生体系得以建立（刘进平，2005）。多种因素影响原生质体全能性的实现，本文综述了原生质体游离、培养和再生过程中的影响因素及其在甘蓝类蔬菜育种上的应用。

1 原生质体全能性表达

1.1 外植体来源及生理状态

选用的材料在很大程度上影响原生质体的游离效果。物种不同，则外植体的选择也不同。

一般来说，双子叶植物多选用叶片、下胚轴、子叶等器官作为游离材料。如拟南芥（Dovzhenko et al.，2003）、甘蓝型油菜（Watanabe et al.，2002）等常用发芽5～7d的下胚轴或子叶，而烟草常用60～90d苗龄的新鲜叶片（Caboche，1980）；对于多数单子叶植物特别是禾本科植物来说，其原生质体再生体系绝大部分均由幼穗、未成熟胚以及种子盾片等来诱导愈伤组织和悬浮细胞系所建立（Yamada et al.，1986）。如在小麦（Pauk et al.，1994）、百合（Famelaer et al.，1996）、水稻（Tang et al.，2001）、香蕉（Assani et al.，2002）等作物中，只有选用愈伤组织和悬浮细胞系游离的原生质体才可以分裂、分化。

材料的生理状况是影响原生质体质量的因素之一。生长季节、光照、肥水、渗透压及温度都显著地影响原生质体的产量及活力。为调整材料的生理状态，在原生质体游离之前，对供体进行预处理，有利于原生质体的游离。如在 15～25 ℃室温和自然光照下培养的甘蓝无菌苗下胚轴游离原生质体，原生质体产量为 1×106个·g-1（FW），而经 4 ℃低温处理无菌苗，原生质体的产量可增加1倍（Thomas & Elizabeth，1990）。Wallin和Welander（1985）把苹果叶片放在附加质量分数为5 %聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），并添加0.5 μmol·L-1蛋氨酸的W5盐-糖溶液中处理30min，原生质体的产量明显提高。

1.2 材料酶解

酶是影响原生质体游离重要的因素之一，主要降解构成植物细胞壁的纤维素、半纤维素和果胶质。不同植物种类或同一植物的不同器官以及它们的培养细胞，由于细胞壁的结构组成不同，分解细胞壁所需的酶类也不同，而酶解处理就是要用合适的酶组合、最低的酶浓度和最短的酶解时间来获得大量有活力的原生质体。用于植物原生质体分离的酶制剂基本上为纤维素酶和果胶酶，经常搭配使用的酶类还有半纤维素酶、崩溃酶和蜗牛酶。一般而言，纤维素酶浓度为1 %～2 %，果胶酶浓度为0.5 %～1.0 %（Tautorus & Fowke，1991；孙振久和井立军，2001）。酶解pH一般为5.5～5.8（Sinha et al.，2003）。酶解时间从几小时到几十小时不等，但一般以不超过24h为宜（Ochatt，1987）。

1.3 原生质体的培养

获得有活力的原生质体后，在合适的培养条件下，可再生出新的细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团或愈伤组织，形成再生植株。但原生质体能否培养成功受多种因素的影响。

1.3.1 培养方法 原生质体培养方法和细胞培养类似，有液体浅层培养、固体包埋培养和固液结合培养。在这些培养方法的基础上还衍生出了微（悬）滴培养、微型分离法培养、看护培养、念珠培养、琼脂岛培养等。每一种方法都有优缺点，应根据培养目的和材料的不同选择不同的培养方法。在六出花（Motonobu et al.，1997）、月季（Suk et al.，2003）、天竺葵（Nassour et al.，2003）等原生质体培养中，液体培养基的效果优于固体培养基。何龙飞等（1996）进行普通白菜下胚轴原生质体培养时发现，固液双层法的效果最好，有利于改善通气，满足原生质体发育所需营养，固相部分还可以吸附有害物质，从而提高了原生质体的分裂频率。Pan等（2003，2004）研究表明，药用植物蓝刺头（Echinops spinosissimus）叶肉原生质体的培养采用琼脂糖包埋培养较优于液体浅层培养，具有更高的植板效率。

1.3.2 培养基 原生质体的培养基多采用以 MS和 B5培养基为基础的改良培养基，如 KM8p和NT培养基等。一般pH值为5.6～5.8。实验证明糖是原生质体培养中较理想的渗透压稳定剂和碳源，常用的有甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖。近年来，有研究表明某些去离子表面活性剂（如聚醚 F-68）及“氧载体”（如全氟化碳和血红蛋白）的添加可以提高原生质体的分裂频率和植板效率，如在苦茄（Solanum dulcamara）的原生质体培养基中添加终浓度为0.1 %（W/V）的聚醚F-68，可以将植板效率比对照提高26 %（Lowe et al.，2001）。水稻悬浮细胞游离的原生质体培养中添加全氟化碳试剂后的植板效率比对照增加了5倍，并且这种促进作用存在于整个培养阶段，使最终的芽再生频率也比对照提高了12 %（Lowe et al.，2003）。

原生质体培养基中添加的激素种类主要有生长素类（常用的有萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、吲哚丙酸等），赤霉素类（常用的有赤霉酸）和细胞分裂素类（常用的有 6-苄基腺嘌呤、玉米素等）。不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要求存在很大的差异，通常认为在原生质体的前期培养中，需生长素来诱导分裂；而后期的分裂分化中，则是细胞分裂素起主导的作用（Dudits & Fehér，2000）。

1.3.3 培养密度 原生质体培养的常规技术是群体培养，培养密度对细胞的生长十分重要，密度条件一般在5×103～5×105个·mL-1时，植物原生质体才能正常分裂与发育（Davey et al.，2005）。密度过高时，由于营养不足或细胞代谢物过多而抑制再生细胞的正常生长；密度过低时，原生质体再生细胞不能持续分裂，这可能是因为原生质体在培养过程中，本身会释放具有与分裂有关的物质，原生质体密度过低，这种物质达不到一定的浓度而影响分裂（Horita et al.，2003）。Matsubayashi和Sakagami（1998）对芦笋的研究发现，当原生质体培养的浓度低于每毫升5×104个时，则培养细胞根本不分裂；而黄籽甘蓝原生质体培养的适宜密度为 6×103～6×104个·mL-1（李名扬和罗金华，1995）。

1.4 原生质体的再生

至今，虽然已有46科160多属360多种植物（包括亚种、变种）的原生质体成功地获得了再生植株，但主要集中在茄科、伞形科、十字花科、菊科、豆科和禾本科的几个属（刘进平，2005）。原生质体植株再生途径通常有 3条：经细胞团发育形成愈伤组织，再分化成芽，进而长成植株；直接形成胚状体，再发育成植株；先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化形成胚状体，最后发育成植株。胚状体途径分化成苗，可以避免愈伤过程可能给分化带来的困难，而且能更好地保持再生植株的遗传稳定性，避免愈伤化可能产生的倍性和染色体变异。目前只有芦笋（Hisato & Masahiro，1990）、香蕉（Panis et al.，1993）等少数几种植物是通过体细胞胚胎发生途径再生成植株，多数植物还是先形成愈伤组织，然后分别诱导芽和根。

2 原生质体全能性表达在甘蓝类蔬菜育种上的应用

甘蓝（Brasscia oleracea L.）属十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brasscia），包括结球甘蓝、羽衣甘蓝、抱子甘蓝、球茎甘蓝、皱叶甘蓝、花椰菜、青花菜、芥蓝等多个变种，是普遍栽培的重要蔬菜作物（周庆红 等，2003）。至今，原生质体全能性表达及以此为基础的体细胞杂交和遗传转化技术在甘蓝类蔬菜作物育种中已得到较为广泛的运用。

2.1 利用原生质体培养进行遗传转化

目前甘蓝外植体遗传转化主要以无菌苗的茎、芽、叶片、子叶、愈伤组织等为受体，取材容易，操作相对简便，但由于受体多为多细胞系统，所形成的转化植株多为嵌合体，这给目标性状的纯化和稳定遗传带来一定的困难。而原生质体是单细胞系统，没有或较少受周围细胞和微环境的影响，再生的植株也是由单细胞发育而来，性状易纯化且稳定遗传。所以向原生质体导入外源基因比向其他外植体导入外源基因有更大的优势。另一方面，由于原生质体去除了细胞壁的保护，可避免核酸酶对异体DNA的破坏，原生质体较易从外界摄入病毒、细菌、细胞器、蛋白质、核酸等，使得外源基因容易导入（Rakoczy-Trojanowska，2002），因此利用原生质体导入外源基因将为甘蓝类蔬菜的基因转化带来一条新的途径。Mukhopadhyal等（1991）报道甘蓝下胚轴原生质体在聚乙二醇（PEG）的介导下，直接摄取了抗潮霉素（Hygromgcin）的标记基因的质粒DNA，转化频率10 %～33 %，而且获得了转化再生植株。杨仲南和许智宏（1994）通过PEG介导研究了外源GUS基因在花椰菜原生质体中的瞬间表达。薛红卫和卫志明（1996）将GUS基因导入甘蓝下胚轴原生质体并获得转基因植株。Eimert（1992）用花椰菜叶肉原生质体，通过电激法转化得到了抗性芽。Radchuk等（2002）也利用花椰菜叶肉原生质体为受体，通过PEG介导的转化方法获得了转基因阳性植株。

2.2 利用原生质体培养获得无性系变异

由于原生质体无细胞壁，它对培养体系中理化因素的影响更为直接和敏感，且在培养条件下的代谢过程与在植株体内并不完全相同，所以在原生质体培养过程中容易产生无性系的变异，这些变异植株已广泛应用于育种工作中。首先，产生的变异为选择新优材料提供了可能，为品种选育提供了材料；其次，由于原生质体培养再生植株变异是在培养过程中发生的，不需经过其他特殊的操作和选择。因此，能够缩短育种年限，节约时间，加速育种进程；第三，在现有研究条件下，通过酶解法能够分离得到大量的原生质体，使得变异发生面广、幅度大、整齐度高而且稳定快，因而可以获得大量的变异材料。熊新生等（1988）在甘蓝原生质体再生植株中发现了二倍体、四倍体，同时也发现部分非整倍体。Sheng等（2011）在花椰菜下胚轴原生质体的再生植株中也发现了少量的四倍体和六倍体。

2.3 利用体细胞杂交创造新的遗传变异

通过体细胞杂交产生体细胞杂种，为植物育种提供了一条克服生殖隔离，提高变异的新途径。体细胞杂交可以在亲缘关系比较远的物种间或者在栽培种与野生种之间进行，并且细胞质和细胞核基因同时参与杂交，经过进一步选择、回交，甚至继续进行体细胞杂交，不仅有希望得到蔬菜新类型，还能够丰富蔬菜种质资源。至今，通过原生质体融合已成功获得甘蓝（B.oleracea）与芸薹（B. campestris）（Jourdan et al.，1989；Yamashita et al.，1989）、普通白菜（B. napus）（Yarrow et al.，1990）、芜菁（B. rapa）（Cardi & Earle，1997）、芥菜（B. juncea）（Arumugam et al.，2000）、Brassica spinescens（姚星伟 等，2005）、黑芥（B. nigra）（张丽 等，2008）等芸薹属内及甘蓝与Moricandia arvensis（Toriyama et al.，1987）、Moricandia nitens（Yan et al.，1999）、白芥（Sinapis alba）（Hansen & Earle，1997）、亚麻荠（Camelina sativa）（Hansen，1998）、紫罗兰（Matthiola incana）（Sheng et al.，2008）等属间的体细胞杂种植株，这些种间和属间杂种为甘蓝品种改良提供了十分丰富的变异类型和桥梁材料。

2.4 利用体细胞杂交创制雄性不育新种质

在育种上杂种优势有极大的利用价值，而实现杂种优势育种的最简便和有效方法就是利用雄性不育系。目前，大部分蔬菜采用的都是细胞质雄性不育（Cytoplasmicmale sterility，CMS）的不育系。甘蓝中的雄性不育源多为 Ogura胞质不育（又叫萝卜胞质不育）。一般来说，有三种途径获得CMS性状：一是自发产生CMS性状；二是种内或种间有性杂交再回交，转育CMS性状；三是通过体细胞杂交获得CMS性状。自发产生CMS的频率很低，且随机性强，所以不方便利用。通过回交转育CMS性状在结球甘蓝（方智远 等，2001；刘玉梅 等，2002）、花椰菜（陈文辉 等，2010）等作物中已经有成功的例子。但所获得的植株除了CMS特性以外，还常常伴有黄化、蜜腺发育不良、花形态异常和结实率低等异常现象。相关专家认为这些现象是异源细胞质与细胞核之间的不协调或者是异源亲本叶绿体的不协调引起杂种细胞内的叶绿素缺失造成的。这些说法都涉及到细胞质，所以用有性杂交的方法难以弥补。通过体细胞杂交途径进行品种间或物种间cmS性状的转移，则很少发生上述异常现象。Kao等（1992）通过原生质体融合，获得了具雄性不育的Ogura线粒体、青花菜叶绿体和细胞核的胞质杂种，这种胞质杂种雄性不育材料在低温下不黄化，可用于F1种子生产。惠志明等（2006）应用非对称体细胞杂交技术向花椰菜成功转移了甘蓝型油菜中的Ogura雄性不育胞质。

除了依靠原生质体融合转移现有不育基因外，原生质体融合本身也可以产生不育的融合杂种。Kanno等（1997）利用非对称体细胞杂交技术创造了具有CMS性状的甘蓝与萝卜的属间体细胞杂种，为了验证CMS产生的机理，详细分析了杂种叶绿体和线粒体的基因组，认为可能是亲本的线粒体DNA发生重组产生嵌合体所致，也可能是正常的线粒体基因转绿受阻引起的，同时也不排除由细胞核与细胞质不协调造成的。Motegi等（2003）应用可育的甘蓝和可育的萝卜，通过非对称原生质体融合获得了CMS甘蓝，而且该CMS甘蓝与紫甘蓝回交9次仍表现不育性。 RFLP分析表明，该不育品系的mtDNA与OguraCMS型存在高度的结构相似性。

2.5 利用体细胞杂交创制抗病（虫）新种质

甘蓝类蔬菜在生产、贮藏和运输中一直受到各种病虫害的威胁，如黑斑病、根肿病、黑腐病和蚜虫等，严重影响其产量和品质。甘蓝的抗病（虫）性大多是由多基因控制的数量遗传性状，而且在甘蓝栽培种或其没有生殖隔离的植物中很难找到抗源，即使个别品种有一定的抗性，其抗性水平也比较低。但在甘蓝野生种中常常有很好的抗源，传统的育种方法克服不了有性杂交的不亲和性，因此很难利用这些野生植物中的抗源。体细胞杂交特别是非对称体细胞杂交技术为甘蓝类蔬菜抗病（虫）育种提供了一条克服生殖障碍，缩短育种年限的捷径。Hagimori 等（1992）利用体细胞杂交技术成功将萝卜中的根肿病抗源转移到花椰菜中，杂种的抗性与亲本萝卜基本一致。Hansen等（1997，1998）、Sigareva和Earle（1999）用不抗黑斑病的甘蓝分别与对黑斑病高抗的野生植物欧白芥（Sinapis alba L.）和亚麻芥（Camelina sativa L.）进行体细胞杂交。在所获得的体细胞杂种中均有对黑斑病高抗的个体，从而证明已将野生植物中对黑斑病的抗性转入甘蓝。张丽等（2008）和Wang等（2011）利用非对称体细胞杂交技术获得了大量花椰菜和黑芥的体细胞杂种，并成功将野生种质黑芥中的黑腐病抗性转入栽培种花椰菜中。

体细胞杂交在甘蓝类蔬菜抗虫育种方面的应用虽然不多，但也有一些成功的例子。如姚星伟等（2005）和 Sheng等（2008）利用体细胞杂交技术向栽培种花椰菜中分别转移了野生种质Brassica spinescens和紫罗兰的蚜虫抗性。

3 展望

甘蓝类蔬菜是芸薹属作物中原生质体培养技术研究最为活跃的领域。近年来，甘蓝类蔬菜原生质体培养和植株再生技术不断完善，体细胞融合技术特别是非对称细胞融合技术日趋成熟，为甘蓝类蔬菜作物种间杂交和雄性不育等细胞质基因的转育提供了技术保障，但是利用原生质体技术改良甘蓝类蔬菜的遗传性状并将之运用于生产实践中还有很大距离。原生质体技术本身也还存在着很多问题：①原生质体培养的稳定性和可重复性差，存在很强的经验性。同时，原生质体再生植株频率较低，存在很强的亲本基因型限制，而原生质体植株再生的难易会直接影响体细胞杂交育种的成败。②诱导融合过程中的许多因素如诱导物质的使用、融合方法的选择等会直接影响到原生质体的活力和融合率，从而影响细胞杂交的效率。③体细胞杂种特别是非对称体细胞杂种，其本身染色体数目不定，染色体结构发生变异，以及异常的减数分裂等造成杂种不育或育性极差的问题。

面对以上实际问题，今后的工作要加强原生质体培养技术的理论基础研究，将细胞工程和分子生物学手段相结合，找出问题背后的相关调控机制，为改善和解决相关问题提供理论依据。今后应重点在以下几个方面开展工作：①加强对原生质体培养和融合过程中的细胞遗传学研究，比如核质关系、不亲和性、细胞分裂的调控及细胞全能性表达和受阻的机理、遗传物质的重组等，进一步从理论上解决原生质体全能性表达的亲本基因型限制及原生质体融合杂种植株再生频率低的问题。②加强对再生杂种植株的细胞学和分子生物学研究，特别是与育性相关的基因调控机制，为解决杂种育性极低或不育问题提供理论依据。③加强以原生质体为受体的遗传转化技术研究，为改良甘蓝类蔬菜作物品质、抗逆性、产量等性状提供一条新的途径。

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