乳源过敏及低致敏乳制品的研究

胡长利，陈历俊，宋小红，卢阳

（北京三元食品股份有限公司技术中心，北京100085）

乳源过敏及低致敏乳制品的研究

胡长利，陈历俊，宋小红，卢阳

（北京三元食品股份有限公司技术中心，北京100085）

对牛乳蛋白过敏原、牛乳蛋白的改性进行了阐述，并分析了加工过程对牛乳蛋白过敏原的影响，综述了当前国内外低致敏性乳制品的研究开发现状。

牛乳；蛋白过敏；改性

0 引言

牛乳含有多种蛋白质，是优质的营养食品，但也是较易引起过敏的食物之一。婴儿及儿童的牛乳过敏发生率为2%～6%，成人的发生率则较小，为0.1%～0.5%。绝大多数的牛乳蛋白都具有潜在的致敏性，但目前普遍认为酪蛋白、β-乳球蛋白(β-LG)及α-乳白蛋白(α-LA)是主要的过敏原，而牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(LGS)及乳铁蛋白(Lf)是次要过敏原[1]。

在婴幼儿配方奶粉的生产研究中，研究者最早引入了低致敏性的水解牛乳蛋白或者水解大豆蛋白来改善或者降低牛乳潜在的过敏危害。近年来，针对儿童市场推出的各种儿童牛奶逐步被消费者所接受，这无疑会增加儿童食用牛奶而导致过敏的潜在风险。加强对牛奶过敏原的了解，熟悉牛奶加工过程中过敏性蛋白的变化以及开发低致敏性的儿童牛奶是未来儿童乳品市场发展的重中之重，本文就此进行深入阐述。

1 牛乳中乳蛋白过敏原概述

1.1 主要牛乳蛋白过敏原

牛乳中酪蛋白、β-LG、α-LA是最主要的过敏原，其中约82%的牛乳过敏病人都对β-LG过敏。乳蛋白之所以成为过敏原是因为其具有过敏表位。乳蛋白的表位有2种：构象表位和线性表位。构象表位的活性依赖于构象，线性表位则是氨基酸序列的一级结构。不同构象特征和表位影响着乳蛋白过敏原的特征[2]。

1.1.1 酪蛋白过敏原

酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，主要分为αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。大部分对酪蛋白过敏的病人对这4种酪蛋白都过敏。酪蛋白与血清IgE反应的强弱程度差异较大，且与乳中4种酪蛋白的比例相关。这4种酪蛋白都是磷酸化的蛋白，分子中那些大量磷酸化残基的酸性肽链对蛋白的致敏性及不同酪蛋白间的交叉反应起重要作用。酪蛋白分子通过疏水相互作用形成非刚性的“random coi”三级结构，这种结构松散易变，易被蛋白酶破坏，因而被认为具有较弱的致敏性。但酪蛋白在牛乳中含量较高且有较多的线性表位，仍然是一种主要过敏原[3]。

1.1.2 β-LG过敏原

β-LG是牛乳乳清中的主要蛋白质，约占牛乳总蛋白的10%，研究发现不存在于母乳中。β-LG是高度结构化的蛋白质，有7%～10%的α-螺旋，43%～51%的β-折叠，耐酸和耐蛋白酶水解，胃蛋白酶不能将其水解，因此消化后人体内还存在着完整的β-LG，可能会引起过敏反应[4]。

1.1.3 α-LA过敏原

α-LA属于溶菌酶家族的蛋白，含有123个氨基酸残基，4个二硫键。α-LA的氨基酸序列与人乳α-LA的氨基酸序列有高度的一致性，然而仍然是主要的乳蛋白过敏原，这说明三级结构对α-LA的过敏原性具有重要作用。α-LA有N型构象（天然构象）和A型构象（酸构象）；当pH＜5时，N型向A型转移，在乳的正常pH值（6.6～6.8）时，呈N型构象[5]。

1.2 牛乳蛋白过敏原的改性

目前，通过蛋白质改性技术，对牛乳蛋白质进行改性是研究热点。所谓蛋白质改性，就是用生化因素(如化学试、酶制剂等)或物理因素(如热、射线等)使其氨基酸残基和多肽链发生某种变化，引起蛋白质大分子空间结构和理化性质的改变，从而消除或者降低牛乳的过敏性，获得较好功能特性和营养特性蛋白质。

1.2.1 热处理改性

热处理导致蛋白质之间共价或非共价的相互作用，生成聚合物。这种热诱导性聚合物在一定程度上将过敏蛋白原的抗原决定部位掩盖，降低了过敏性。通常55～70℃时蛋白质结构展开，三级结构破坏；70～80℃时S-S键断裂，分子内分子间发生新的相互作用；80～90℃时二硫键重排；90～100℃时β-LG通过S-S键与κ-酪蛋白键连接形成聚合物，然后形成凝胶，蛋白质表面特性改变，表面积增大。热处理后蛋白质结构变化的性质和程度取决于热处理的温度和时间，蛋白质的内在性质和物化条件(如pH)对其也有影响[6]。

1.2.2 糖基化作用改性

将碳水化合物以共价键与蛋白质分子上的氨基(主要为Lys的ε-氨基)或羧基相结合的化学反应(包括美拉德反应)，称之为蛋白质的糖基化作用，这种方法也被广泛的用来降低乳蛋白的抗原性，提高乳蛋白质的功能特性。

聚乙烯乙二醇及其衍生物(PEGs)与蛋白质的糖基化反应在温和的条件下进行，PEGs易与蛋白质分子产生胶联，PEGs可中和乳蛋白表面电荷，结合了PEGs的乳蛋白的抗原性明显降低，甚至完全消除。

羧甲基葡聚糖(CMD)是一种理想的抗原决定部位的屏蔽物。将CMD结合在β-LG上，形成的β-LGCMD具有高热稳定性，无过敏性，能保持结合维生素E的活性。另外，以葡萄糖胺(GLCN)、壳聚戊糖(CPO)和壳聚糖(CHS)、海藻酸寡糖(ALGO)和磷酸寡糖(PO)为改良剂，结合成β-LG-GLCN、β-LG-CPO、β-LGCHS、β-LG-ALGO和β-LG-PO。通过ELISA免疫试验发现，其抗原性和免疫原性都降低[6]。

1.2.3 酶水解改性

蛋白酶催化乳蛋白具有表位的片段水解，可显著降低其抗原性，防止牛乳过敏。Kananen等用硫化氢对乳清蛋白处理使蛋白构象改变，然后用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理，β-LG抗原性显著降低，并且在胰蛋白酶水解30 min后β-LG的抗原性接近0[7]。

Wroblewsak选用了碱性蛋白酶(Alcalase)和木瓜蛋白酶(Papain)单独或组合，分别于水解开始时和水解100 min后加入水解乳清蛋白，3种方式水解时间均为120 min。结果发现：Alcalase和Papain二步水解降低乳清蛋白过敏性的效果最佳[8]。酶的选择是乳清蛋白酶法改性的关键，由于乳蛋白过敏原表位的广泛存在，从众多的蛋白酶中筛选合理的酶具有一定的盲目性。对酶的种类、酶解模式、酶解程度等因素的选择及其酶解过程中各产物对其致敏性与风味的影响机理，还需要进一步的研究。

1.2.4 乳酸发酵改性

乳酸发酵改性的机制可能是乳酸菌产生I型及Ⅱ型干酪素，通过免疫调节机制防止过敏；另一种可能的机制是乳酸菌发酵产生水解乳蛋白的酶，进而水解乳蛋白。据报道，采用灭菌处理的牛乳经蛋白酶水解改性或糖基化改性后，再用乳酸菌发酵处理，改性效果更佳。

1.2.5 脂肪酸改性

Akita等研究了脂肪酸结合β-LG的免疫原性，采用硬脂酸-β-LG的5种不同程度的结合物作为抗原：天然β-LG，0-β-LG，0.3-β-LG，4.0-β-LG以及13.1-β-LG(脂肪酸浓度为0.0，0.0，0.3，4.0，13.1 mol/L赖氨酸)。通过ELISA免疫实验发现，低脂肪酸化β-LG的免疫原性降低，而高脂肪酸化的β-LG的免疫原性并无降低，反而升高。与天然β-LG和13.1含量的β-LG相比，0.3-β-LG具有更高的结合抗体的能力。这可能是由于改性β-LG比天然β-LG具有更多的非折叠结构.从而导致更多的抗原位点暴露[9]。

2 生产加工对乳蛋白过敏性的影响

消除或降低牛乳蛋白质的过敏性生产出低过敏或无过敏的乳制品是乳品工业面临的挑战之一。乳品加工中的物理化学和生物的方法都会对乳制品的过敏原性产生影响。

2.1 加热工艺对乳蛋白过敏性的影响

在加热过程中，蛋白结构发生重要的变化。这种变化的本质和程度依赖于温度和热处理的时间、蛋白的内部特征以及环境的物理化学条件(如pH值)。通常55～70℃时蛋白质结构展开.三级结构破坏；70～80℃时S-S键断裂，分子内和分子间发生新的相互作用；80～90℃时二硫键重排；90～100℃时蛋白质之间通过S-S键联接形成聚合物[2]。

β-LG在酸性pH值下抗变性，在碱性pH值下易变性。β-LG的热变性范围为50～90℃，其不可逆变性发生在pH值为7.0(70℃)。α-LA在64℃时空间构象发生改变.因其缺乏游离的半胱氨酸残基。故无法引起和传播变性反应。但是，当具有游离巯基的蛋白(β-LG、BSA)存在时，α-LA也可能发生部分的聚合。

酪蛋白对热非常稳定，能经受130℃(1 h)，或者150℃(几秒钟)，而不凝结。相反，球状的乳清蛋白是热敏性的，其热稳定性因组分不同而不同，顺序是：LGS＜BSA＜β-LG＜α-LA。在120℃加热15 min并不影响牛乳酪蛋白的抗原性.在70～80℃和100℃加热BSA和LGS失去了抗原性[6]。

2.2 酶解对乳蛋白过敏性的影响

相对于构象型表位而言食品加工对线性表位影响较小，但酶解对线性表位影响较大。深度酶解的婴幼儿配方乳粉已经上市，它降低了乳品的过敏原性，但对极少数人群仍然存在致敏的危险性。

Linda利用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用水解-乳球蛋白发现水解后的乳球蛋白的过敏性降低但不会完全消除[10]。Bernard用胰蛋白酶水解酪蛋白发现其可以水解肽链第152位、53～139位片段；用纤溶酶可以水解酪蛋白的第106～209位片段，这些多肽片段中包含有过敏性表位，经水解后可以使酪蛋白的过敏性降低[11]。

2.3 发酵对乳蛋白过敏性的影响

牛乳经过发酵后其过敏原性会大大降低甚至消失。其原因在于酶解及乳酸引起蛋白质降解，另外发酵后的酸奶能够调整肠道菌群，调节黏膜免疫，对抗食物过敏有很好的作用[12]。

Haddad发现酸奶生产中加热温度为90～95℃，时间10～15 min这时β-LG与酪蛋白微粒结合然后采用嗜温和嗜热乳酸菌或混合菌种37℃发酵。结果发现乳清蛋白的抗原性比鲜乳降低了99%以上[13]。

3 低致敏乳制品的生产

鉴于婴幼儿较高的牛乳蛋白过敏症状发生率和少年儿童由于日益增长的牛乳摄入而引发的牛乳过敏问题，开发低致敏的乳制品已经成为各大乳品企业在新品开发过程中必须考虑的问题。

3.1 低致敏乳品原料的制备

生产低致敏性的乳制品，首先可以优先选择经过特殊处理的乳品原料，以降低乳品过敏的风险。M.Eugenia等报道了一种生产清除β-LG以获得低致敏性的浓缩乳清蛋白的方法，采用超滤、调整pH以及沉淀、水洗等多重复合工艺，可以得到基本不含β-LG的乳品原料，用作为儿童配方奶粉或者其他乳制品的优选原料[14]。

酶法水解乳清蛋白或者酪蛋白来制备低致敏乳品原料应用最为广泛，然而这种方法会导致乳品原料功能性变差，因此有人在酶法水解的基础上，研究了酶法结合高压处理来制备低致敏乳品原料。Chicon等研究了高压条件下酶解酪蛋白的工艺及产品特性，采用100～300 MPa、15 min、温度37℃的工艺，结果表明高压下，乳蛋白对胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等更加敏感，产品不仅致敏性降低，同时也能保持更好的乳化性和热稳定性[15]。

Javier F等结合微波辐照工艺对乳蛋白的酶解进行了研究，结果发现，2450 Hz、560 W、5 min的微波处理条件结合酶解工艺，可以获得更高水解度和更低致敏性的乳品原料[16]。相信随着研究的深入，各种物理、化学或者生物的方法将更广泛的被应用到低致敏乳制品原料的生产加工中，为低致敏乳制品的研制提供更加丰富的备选原料。

3.2 脱敏配方乳制品的研制

利用水解蛋白是获得低敏配方的最好方法，即对蛋白结构进行修饰从而大大减少具有抗原活性物质的量。目前，根据水解的程度，水解蛋白配方分为两种，一种是适度水解蛋白配方(Partially Hydrolyzed Formula，PHF)，又称为部分水解配方；另外一种是完全水解蛋白配方(Extensively Hydrolyzed Formula，EHF)，又称为深度水解配方[17]。

完全水解配方是将牛乳蛋白通过加热、超滤、水解等特殊工艺降低蛋白质成份的抗原性，使其终产物大多为二肽、三肽和少量的游离氨基酸。过敏原独特型表位的空间构象和序列大大减少，显著降低了抗原性。完全水解配方已显示能有效地降低牛乳蛋白过敏的发生，并被推荐用于牛乳蛋白过敏婴儿的治疗。研究证明完全水解配方与氨基酸配方对特应性皮炎的治疗效果相似，完全水解蛋白配方与氨基酸配方都能支持婴儿正常的生长发育。

适度水解配方是对牛奶蛋白进行适度的水解，利用蛋白酶切断肽链，使之成为小肽段，改变牛奶蛋白的表位(抗原决定基)，从而降低蛋白的抗原性，但还保留微量抗原活性。由于保留了部分抗原性，婴儿持续少量牛奶蛋白抗原的摄入可以诱导免疫耐受。因此，适度水解配方通常推荐用于特应性高风险婴儿的初级干预，以及牛奶过敏的婴儿经过一段时间的完全水解配方治疗后，症状缓解后的续贯治疗，以期诱导耐受。

完全水解蛋白和适度水解配方在过敏的初级预防方面的效果孰优孰劣，目前尚无定论。适度水解蛋白配方曾被多项临床研究证实具有过敏预防效果，被推荐作为婴幼儿过敏预防的早期膳食干预。Halken等发现完全水解配方喂养有非常好的临床效果，但适度水解配方喂养在介导对牛奶蛋白质和其他食物蛋白质的耐受性方面也有良好的效果，并且还可促进对吸人性抗原耐受性。有大量研究显示，适度水解配方可降低婴儿特应性皮炎的发生，并且这种预防效果可持续到3岁以后[18]。

3.3 低致敏发酵乳制品的研制

近年来的研究表明，食用发酵食品，尤其是以牛乳为基料的乳制品可减轻一些遗传性过敏的症状并限制病症的发展。因此将益生菌应用于乳制品中，开发新的功能水解物是减缓乳品过敏的有效技术。研究发现，发酵乳中β-LG，α-LA，αs-酪蛋白；β-酪蛋白和BSA的抗原降解率分别为20.54%，31.8%，4.08%，18.67%和25.47%。郭鸰等进行了发酵生产低致敏乳源蛋白基料的相关研究，发现采用一株瑞士乳杆菌为发酵剂，在10%的脱脂乳中添加5%的乳清蛋白为发酵原料制备低致敏乳源蛋白是可行的[19]。

目前在国内市场上销售的儿童牛奶，配方仍然选择鲜乳或者乳粉，还没有一款以发酵乳为基料的产品问世。牛乳中含有大量的酪蛋白，在乳酸菌发酵过程中，酪蛋白的抗原降解率较低，近期，在日本有企业开发出了适合6个月大婴儿食用的发酵乳制品，这种产品酸度较低，且特别添加果蔬汁，强化营养。Nicole等研究发现，采用Streptococcus thermophilus subsp.和Salivarius strain复合菌种发酵脱脂牛奶，可使β-LG减少约90%；发酵甜乳清，可使β-LG减少约70%[20]。因此国内企业及相关研究机构可通过菌种优化筛选的方法来生产酪蛋白有较高脱敏率的发酵型产品，或者通过采用乳清蛋白为原料进行低致敏性发酵乳制品的开发，以提高乳制品的附加值。

3 结束语

牛乳蛋白营养丰富，是不可多得的良好膳食补充。虽然牛奶蛋白可能引起人体，特别是婴幼儿的过敏症状，但牛乳蛋白经在婴幼儿配方奶粉中的脱敏研究已经有了长足的发展，并有着较为成熟和安全的产品配方，以保障婴幼儿的营养摄入和饮食安全。牛乳蛋白过敏在少年儿童和成年人中也有一定的发生率，因此同样需要引起重视，开发低致敏性的儿童配方乳制品等乳品。相信通过乳品科技工作者对牛乳蛋白过敏源的科学认识，并通过加工、改性等一系列手段进行脱敏处理，设计合理的低致敏性乳制品配方，定会为消费者奉上健康安全的乳制品。

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Milk allergy and the study of hypoallergenic dairy produt

HU Chang-li,CHEN Li-jun,SONG Xiao-hong,LU Yang
（Beijing Sanyuan Food Co.ltd.,Technigue Center,Beijing 100085,China）

Milk allergy is a kind of common food allergy,Milk protein allergy,milk protein modification were expounded in this paper.The effect of processing on milk protein allergy is analyzed and the current development of hypoallergenic dairy products is also reviewed.

milk；protein allergy；modification

TS252.1

B

1001-2230（2011）03-0042-04

2010-07-22

胡长利（1980-），男，博士，研究方向为乳品科学与技术。

陈历俊