乳及乳制品中动物水解蛋白L-羟脯氨酸的检测技术

李洋，满朝新，赵秋莲，刘珊珊，刘颖，董鑫悦，姜毓君

（国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨 150086)

乳及乳制品中动物水解蛋白L-羟脯氨酸的检测技术

李洋，满朝新，赵秋莲，刘珊珊，刘颖，董鑫悦，姜毓君

（国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨 150086)

介绍了检测乳及乳制品中L-羟脯氨酸的常用方法，主要包括高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、氨基酸自动分析仪测定法，毛细管电泳-激光诱导荧光检测法和分光光度法，并对今后乳及乳制品中动物水解蛋白检测技术的发展趋势进行了分析。

动物水解蛋白；L-羟脯氨酸；检测；乳及乳制品

0 引言

乳中掺入动物水解蛋白是提高乳中蛋白质含量的掺假手段之一。动物水解蛋白是由动物皮革及其制品下脚料等水解得到的蛋白质，长期饮用会引发人体中毒，所以，国家禁止在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白。L-羟脯氨酸是动物水解蛋白中胶原的特征性氨基酸之一，其质量分数相对稳定[1]，而乳中是不含这种氨基酸的。因此，可以将L-羟脯氨酸的有无作为检测乳及乳制品中是否掺入动物水解蛋白的标示物[2]。

目前，针对L-羟脯氨酸的测定方法主要有高效液相色谱法[3]、高效液相色谱-质谱联用法[4-5]、氨基酸自动分析仪测定法[6]、毛细管电泳-激光诱导荧光检测法[7]、分光光度法[8]，本文对相关检测技术进行了综述。

1 检测技术

1.1 柱前衍生高效液相色谱法

高效液相色谱在分析实验室已越来越普及。柱前衍生是一种先将氨基酸转化成衍生物，再进行色谱分离的衍生方法，柱前衍生高效液相色谱法分析L-羟脯氨酸，常用的柱前衍生试剂是2,4-二硝基氟苯(DNFB)[9，10]，该衍生试剂衍生得到的衍生物稳定性好，并且过量的DNFB对分析没有影响。色谱柱通常采用C18柱，衍生条件为样品与衍生剂涡旋混合10～15 s后室温下放置1 min，然后在55℃烘箱内加热10 min。检出限可达到2.5 mg/L[9]。该方法具有较高的准确度和良好的重现性，具有分析时间短，成本低，重现性好，适用样品范围广等特点，可作为乳及其他乳制品中L-羟脯氨酸含量的检测方法。

金苏英[11]等采用柱前衍生反相高效液相色谱法测定奶粉及其他乳制品中L-羟脯氨酸。样品经酸水解后，用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC试剂）衍生水解样品中的L-羟脯氨酸，以磷酸盐缓冲溶液、乙腈、水梯度洗脱，通过symmetry C18柱将L-羟脯氨酸与其他18种氨基酸分离，在248 nm波长下用紫外检测器检测。测定结果为，在浓度为0～2.05 mmol/L范围内，标准曲线呈良好的线性关系（r= 0.9991），加样回收率为95.1%～101%，方法精密度RSD（n=7）为1.3%。该方法具有简单、稳定、灵敏度高、准确等优点。

唐志毅[12]等采用邻苯二甲醛和芴甲基氯甲酸酯两个衍生剂测定尿中的羟脯氨酸，以C8柱为色谱柱，无杂质干扰，特异性好；研究者也有以异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生试剂，测定了保健食品中游离和非游离的L-羟脯氨酸[13]。这两种方法也可以在乳及乳制品中L-羟脯氨酸的检测中加以应用。

1.2 高效液相色谱-质谱联用法检测法

高效液相色谱-质谱联用（HPLC/MS）的研究已经有了约30年的发展历史，并且在分析氨基酸方面得到了较多的应用。质谱具有灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的特点，是高效液相色谱-质谱联用将液相色谱与质谱相结合的方法。随着HPLC/MS的发展，其在化工、生物、医药和农业等各个领域中均得到了广泛的应用。

王一红等[5]采用HPLC/MS法，用电喷雾ESI源,在正离子模式下建立了18种游离氨基酸的测定方法，通过选择反应监测（SRM）方式对18种氨基酸的母离子及子离子进行监测，并用三级四极质谱测定。测得结果回收率为95%～104%，相关系数0.9931～0.9999，检出限为0.5～8 mol/mL。

1.3 氨基酸自动分析仪测定法

氨基酸自动分析仪测定法是一种离子色谱柱后衍生法，经过阳离子交换柱的分离作用，能使L-羟脯氨酸与其它氨基酸分离，L-羟脯氨酸再与茚三酮反应生成黄色产物，并在波长440 nm检出。使用氨基酸自动分析仪来分析L-羟脯氨酸，在其标准分析条件下即可实现L-羟脯氨酸与其他氨基酸的完全分离，因而该方法更加准确、快速，并且其灵敏度和自动化程度很高。利用氨基酸自动分析仪法测定乳及乳制品中L-羟脯氨酸，可以直接进行对L-羟脯氨酸的分析，避免了氨基酸衍生产物的多样性，也不用考虑样品中氨基酸衍生不彻底等问题，该方法样品处理简便易操作，能快速、准确地判断乳及乳制品中是否添加了动物水解蛋白。并且，在测定L-羟脯氨酸质量浓度的同时，又可以同时测定出其他的16种水解氨基酸。

张秀尧[14]等人采用氨基酸自动分析仪法检测乳及乳制品中L-羟脯氨酸，将样品酸水解后，直接用氨基酸自动分析仪检测。测定结果检出限为0.3 mg/L，加标回收率在96.8%～107%之间，相对标准偏差为0.40%～4.9%。所以，氨基酸自动分析仪法适合于乳与乳制品中是否添加动物水解蛋白的鉴定，具有非常好的应用前景。

曾暖茜[15]等人用氨基酸自动分析仪测定乳制品中L-羟脯氨酸，当L-羟脯氨酸质量浓度在5～30 mg/L范围内,L-羟脯氨酸的质量浓度与峰面积之间线性关系良好，实验测得样品的相对标准偏差为2.2%，加标回收率为94.9%～105%，平均回收率为98.4%。

1.4 毛细管电泳-激光诱导荧光检测法

毛细管电泳-激光诱导荧光检测法的原理是胶原蛋白碱水解生成氨基酸，经异硫氰酸荧光素(FITC)衍生，再通过LIF-CE分离后，测定胶原蛋白特异性氨基酸L-羟脯氨酸。毛细管电泳-激光诱导荧光检测可大大提高测定的灵敏度，从而满足生物样品测定的要求。已有诸多报道采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测法测定氨基酸，并取得满意的分析结果[16]。而将该法用于测定L-羟脯氨酸，国内外仅有少量报道[17]。

邹晓莉[7]等采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测法分离测肌腱中的L-羟脯氨酸。将胶原蛋白碱水解生成氨基酸，用异硫氰酸荧光素衍生，采用LIF-CE分离测定L-羟脯氨酸。测定结果为，在0.5～8×103μg/L质量浓度范围内线性关系良好，检出限为0.5 μg/L。相对迁移率和相对峰高的相对标准偏差(RSD)分别为5.0%和6.1%，加标回收率为95%～110%。

1.5 分光光度计检测法

相对而言，高效液相色谱法和液谱-质谱联用法所需要的仪器尚未普及，而且成本相对较高，所以这两种方法在基层实验室和某些企业中会受到限制，因而需要建立一种实验设备简单、操作简便、对设备仪器要求较低的实验方法来检测乳及乳制品中的L-羟脯氨酸，以便于推广。

分光光度计法在肉与肉制品中L-羟脯氨酸质量浓度测定中比较常用，在1990年即被列入国家标准，并且一直沿用至今。由此发展而来的用于乳及乳制品检测的L-羟脯氨酸-氯胺T法，其原理是动物水解蛋白水解出来的游离的L-羟脯氨酸可以被氯胺T氧化，生成吡咯类化合物，在一定的温度下该化合物能与对二甲氨基苯甲醛生成一种红色化合物[18]，在可见光波长下该红色化合物有一定的吸收，故可通过分光光度计来测定其质量浓度[19]。该方法样品前处理简单、分析速度较快、应用范围广泛，其重复性和检测限均可基本满足要求。戴绚丽等[20]先用盐酸水解奶粉，然后用氯胺T法测定了其水解后的L-羟脯氨酸。该方法的线性范围为0.002～3 μg/L，回收率在90.06%～94.1%，相对标准偏差＜5%。

2 结果与展望

本文所介绍的高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、氨基酸自动分析仪测定法、毛细管电泳-激光诱导荧光检测法以及分光光度计法测定乳及乳制品中的L-羟脯氨酸，各有优点和不足。高效液相色谱法是目前实验室较为常见的分析检测方法，该方法前处理简单，具有稳定性好、准确度高等特点，近年来在多个检测领域得到了极为广泛的应用；高效液相色谱-质谱联用法也是现阶段的一个重要检测方法，但由于其耗材贵、成本高使不少实验室望而止步，同时高效液相色谱-质谱联用法在定量方面与高效液相色谱法相比还有一定差距；分光光度计法在常规的实验室均可以进行，该方法前处理和所需实验设备更为简单，可以快速的检测乳制品中的L-羟脯氨酸，但在检测灵敏度方面与高效液相法相比还有很大的不足，准确性较差也使得该方法受到了一定的限制，适用于样品的初筛。氨基酸自动分析仪测定法避免了氨基酸衍生产物的多样性和氨基酸衍生不彻底等问题，样品处理简便易操作，快速、准确，对于具备该仪器的实验室，此方法是一较好选择。毛细管电泳-激光诱导荧光检测法和高效液相色谱-质谱联用法一样，由于仪器设备等因素，目前在国内应用还不多。

以L-羟脯氨酸为特征性指标检测乳及乳制品中的动物水解蛋白的常用方法。动物胶原蛋白的另一个特征水解产物是羟赖氨酸，但通过液相质谱检测发现羟赖氨酸在植物中也含有[21]，因此也难以作为特征性检测指标。今后能否将动物蛋白水解液中的脂肪酸、有机酸等作为动物蛋白水解特征产物，仍需进一步研究。此外，现有检测乳及乳制品中动物水解蛋白的方法都需要一定的仪器设备，难以满足现场执法等快速检测的需要，因此更为快速有效的检测手段（如检测试纸条等）也将具有非常广阔的前景。

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Detection of L-Hydroxyproline of Hydrolyzed animal protein in the milk and dairy products

LI Yang，MAN Chao-xin，ZHAO Qiu-lian,LIU Shan-shan，LIU Ying，DONG Xin-yue，JIANG Yu-jun
(National Dairy Engineering&Technical Research Center，Harbin 150086，China)

This paper reviews several methods to detect the L-hydroxyproline,including high performance liquid chromatography,high performance liquid chromatography mass spectrometry,automatic amino acid analyzer,capillary electrophoresis-laser induced fluorescence detection,and spectrophotometry.In addition，the trends of related techniques to detect hydrolysis of animal protein in milk and dairy products were predicted.

Animal protein hydrolysate；L-hydroxyproline;detection;milk and dairy products

TS252.7

B

1001-2230（2011）05-0047-03

2011-01-20

国家科技支撑计划（2009BADB9B06）。

李洋(1987-)，女，硕士，研究方向为食品安全。

姜毓君