P49重组抗原检测旋毛虫抗体的间接ELISA方法建立

李晓云，路义鑫，韩彩霞，朱江巍，宋铭忻

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

旋毛虫病（Trichinellosis）是一种重要的人兽共患寄生虫病，主要因生食或半生食含旋毛虫幼虫的肉类所致。该病的流行不但对畜牧业、食品业及外贸出口造成了重大经济损失，而且对人类健康构成威胁［1－2］，因而及时准确地诊断并治疗旋毛虫病显得至关重要。ELISA作为一种快速的诊断方法具有方便、快捷、成本低的优点，成为目前国内外在疾病诊断方面最重要的方法之一，特别是在血清诊断、大规模普查以及海关的进出口检疫方面。旋毛虫感染过程中排泄－分泌（excretory－secretory，ES）抗原直接暴露于宿主的免疫系统，是诱导宿主产生免疫反应的主要靶抗原，在旋毛虫病的免疫病理、免疫诊断及免疫预防方面具有重要作用。ES抗原中，主要的特异性蛋白成分有3种，分子量分别为45、49ku和53ku，占 ES总量的50%以上［3－4］。本试验利用原核表达获得的旋毛虫49ku ES重组抗原，初步建立了检测血清中抗旋毛虫排泄分泌蛋白P49抗体的间接ELISA方法，旨在为旋毛虫新型ELISA抗体诊断试剂盒的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验用材料

1.1.1 重组抗原 纯化的本地毛形线虫（T.nativa）P49重组蛋白，表达该蛋白的菌种由本实验室保存。

1.1.2 血清T.nativa标准阳性和阴性血清制备方法如下：以T.nativa肌幼虫200条感染健康昆明系小鼠，30d后眼球采血，分离血清即为旋毛虫阳性血清，采取健康昆明系小鼠血清即为阴性血清。

1.1.3 其他材料 96孔ELISA可拆酶标板，购自加拿大JET公司；羊抗鼠IgG－HRP和四甲基联苯胺二酸盐（TMB），购自Sigma公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2 间接ELISA反应参数的确定

1.2.1 重组抗原包被浓度和血清稀释度 采用矩阵滴定法。将P49抗原以包被液（pH值9.6，0.05 mol／L碳酸盐缓冲液）倍比稀释，每个稀释度1行包被96孔酶标板，100μL／孔，4℃过夜；以PBST洗涤拍干；加封闭液200μL／孔，37℃作用2h，同法洗涤拍干；再按列加入倍比稀释的标准阴、阳性血清作矩阵滴定，每个稀释度1列，100μL／孔，37℃保温，同法洗涤拍干；按间接ELISA程序加入酶标二抗，加入底物显色，测定OD值。选择阳性血清OD450值（P）为1.0左右，阴性血清OD450值（N）较低，且P／N比值最大所对应的抗原、抗体稀释度为最佳抗原包被浓度和血清稀释度。

1.2.2 封闭液和稀释液的选择 按1.2.1确定的参数包被抗原，分别采用50g／L脱脂乳、30g／L明胶、10g／L牛血清白蛋白（BSA）、5g／L 聚乙烯醇（PVA）作为封闭液进行ELISA，加血清环节，分别以含0g／L、20g／L、40g／L和80g／L 浓度 PEG 6000的PBS作为稀释液稀释血清，按间接ELISA程序检测。根据阴、阳性血清平均OD值，选择最适封闭液和稀释液。

1.2.3 血清作用时间 按上述已确立的参数包被抗原和血清，分别于37℃作用30、60、90min和120 min，按间接ELISA程序试验，比较各组P／N值，选择血清（一抗）作用的最佳时间。

1.2.4 酶标二抗（羊抗鼠IgG－HRP）最佳工作条件

根据上述确定的参数包被抗原和血清，羊抗鼠IgG－HRP以稀释液按1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000和1∶20 000稀释，分别于37℃作用30、60、90min和120min，按间接ELISA程序操作，比较阴、阳性血清平均OD450值和P／N值，确定最适酶标二抗工作条件。

1.2.5 最佳底物作用时间 根据上述已确立的条件，改变底物作用时间为5min、10min、15min、20 min，比较各组阴、阳性血清的平均OD450值，以确定最佳底物显色时间。

1.2.6 间接ELISA判定标准 取20份阴性血清，按已确立的最适反应条件进行间接ELISA检测，按统计学方法计算阴性血清的平均OD450值和标准差（S），以作为临界值。

1.3 P49－ELISA体系评价

1.3.1 重复性试验 取10份血清样品（阳性、阴性各5份），每份重复5孔，分别使用同一批次和不同批次包被的ELISA反应板，进行批内和批间重复性试验，计算变异系数CV（%）。

1.3.2 敏感性试验 将本地毛形线虫（T.nativa）以5、10、15、20、25、30、35条和40条分别感染健康昆明系小鼠，每组3只。以健康鼠为对照。在感染后第1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、30天于尾静脉采血分离血清，进行间接ELISA检测，确定该法的敏感性。

1.3.3 交叉反应试验 分别检测本实验室保存的不同来源的旋毛虫分离株的阳性和阴性血清，包括本地毛形线虫、旋毛形线虫、黑龙江猪旋毛虫、黑龙江犬旋毛虫、黑龙江猫旋毛虫和美国猪旋毛虫，观察旋毛虫各种株阳性血清之间交叉反应情况。

2 结果

2.1 间接ELISA方法的建立

2.1.1 抗原包被浓度和血清稀释度的确定 方阵滴定结果表明，当抗原包被浓度为4μg／mL（即稀释度为1∶100），血清稀释倍数为1∶100时，阳性血清OD450值（P）为1.018，阴性血清 OD450值（N）为0.088，P／N比值最大为11.568。

2.1.2 最佳封闭液和稀释液 封闭液为5g／L聚乙烯醇（PVA），稀释液中含PEG6000浓度为20g／L时，阳性血清OD450明显上升，同时对阴性血清OD450影响不大，且阴、阳性血清平均OD450之比P／N最大，可见最佳封闭液为5g／L聚乙烯醇，最佳稀释液为含20g／L PEG6000的PBS。

2.1.3 血清最佳作用时间 在37℃下血清（一抗）和已包被的抗原作用90min时，阴性血清OD值较小，阴、阳性血清平均OD450之比P／N最大。故在37℃下，血清最佳作用时间为90min。

2.1.4 酶标二抗最佳工作条件 当酶标二抗稀释度为1∶10 000，37℃下作用60min时，阳性与阴性血清平均OD450之比（P／N）最大。因此酶标二抗最佳工作浓度为1∶10 000，最佳作用时间为37℃60 min。

2.1.5 底物最佳显色时间 底物作用15min时，阳性血清 OD450接近于1.0，且阴性 OD450较小，P／N比值较大，因此选择15min作为最佳底物作用时间。

2.2 间接ELISA体系评价

2.2.1 重复性试验结果 对10份血清样品进行间接ELISA检测，批间、批内的变异系数分别为6.84%、5.59%，均小于10%，说明建立的间接ELISA具有较好的重复性。

2.2.2 敏感性试验结果 于第6天100%检出感染20条／只以上的昆明系小鼠，并分别于13d 100%检出感染15条／只、19d100%检出感染10条／只，并在25d100%检出感染5条／只的昆明系小鼠，即在第25天所有感染鼠血清检出阳性。可知感染鼠最早检出抗体阳性的时间为第6天。

2.2.3 交叉反应试验结果 结果均为阳性，表明6个旋毛虫种株之间具有交叉反应，说明P49重组抗原建立的间接ELISA可用于检测不同种株旋毛虫感染。

3 讨论

目前对旋毛虫病的检疫国内常采用传统的压片镜检法，但其敏感性为肉中虫体密度达到每克肌肉3条时方可检出。虽然消化法被认为是检测旋毛虫的金标准，可将虫体检出率提高至每克肌肉1条虫体，但该法十分繁琐，费时较长。Monroy等［5］用镜检法和人工消化法检测539头猪的膈肌，同时用ELISA法检测血清样本，结果镜检法和人工消化法的检出率为0，ELISA法的检出率为12.4%。由于ELISA法具有经济、敏感性和特异性高等优点而被广泛应用，国外己将ELISA法作为猪旋毛虫病宰前的常规检查方法。ELISA检测的特异性和敏感性与所使用的抗原质量有重要关系。天然ES抗原制备复杂，来源受限制，影响了ES抗原的应用。基因重组抗原具有可以大量制备、特异性好等特点，而且用量比天然ES抗原低10倍，且可排除与猪蛔虫、猪鞭虫的交叉反应。因此基因重组抗原的应用成为肉品中旋毛虫检疫的发展方向。

旋毛虫49ku ES重组蛋白在旋毛虫病检测和预防方面具有潜在应用价值。Western－blot分析表明，该重组蛋白P49能被鼠旋毛虫病阳性血清特异性识别，而不与正常鼠和兔的阴性血清反应［6－7］。本试验建立了P49重组抗原检测旋毛虫抗体的间接ELISA方法，并对各项反应参数进行摸索。抗原浓度和血清稀释度适宜与否会影响ELISA检测的特异性和敏感性，通过方阵滴定确定了最佳抗原包被浓度4μg／mL和血清稀释度1∶100。对稀释液的优化中，尝试加入不同浓度PGE6000，结果表明，PGE6000浓度为20g／L时，ELISA体系P／N值最高。PGE6000通过空间排阻效应增强抗原－抗体相互作用，这种加强作用本身是非特异性的，加大浓度延长作用时间，都会使背景值加大，且在室温下即可进行。间接ELISA最后的显色也很关键，某一特定的ELISA检测程序中，最佳显色时间应该是固定的，试验结果表明，随着显色时间的延长，阴、阳性血清的OD450都会上升，室温下显色15min时P／N达最大，从而确定15min为最佳底物显色时间。

建立的间接ELISA方法用于旋毛虫感染鼠血清抗体检测，重复性好，灵敏度高，并且交叉反应试验表明，可用于检测不同种株的旋毛虫感染，可能是因为不同种株旋毛虫编码P49蛋白的基因序列高度同源，只要获得一个种株的重组P49蛋白，即可用于检测其他不同种株的旋毛虫感染［8］。本试验建立的间接ELISA方法克服了压片镜检和消化法费时、费力及检出率低的不足，为研制检测猪、犬、猫等旋毛虫病的ELISA试剂盒奠定了良好的基础。

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［3］Su X，Prestwood A K，Mcgraw R A.Cloning and expression of complementary DNA encoding an antigen ofTrichinella spiralis［J］.Mol Biochem Parasitol，1991，45（2）：331－336.

［4］马鸣旺，申丽洁.旋毛虫抗原的研究进展［J］.中国病原生物学杂志，2008，3（8）：631－634.

［5］Monroy H，Flores－Trujillo M，Benitez E.Swine trichinellosis in slaughter houses of the metropolitan area of Toluca［J］.Parasite，2001，8（2Suppl）：S249－S251.

［6］宋思扬，郑忠辉，黄耀坚，等.旋毛虫排泄分泌抗原P49基因的克隆［J］.厦门大学学报，1999，25：117－120.

［7］郑宝亮.本地毛形线虫49ku ES蛋白结构基因的分子克隆及原核表达［D］.哈尔滨：东北农业大学硕士学位论文，2003.

［8］路义鑫，宋铭忻，王洪斌.旋毛虫不同隔离种成囊前期幼虫49ku ES抗原基因的克隆与序列分析［J］.中国兽医杂志，2007，43（7）：7－10.