大黄多糖超声波提取工艺及抗新城疫病毒活性试验

王春花，付云威，张秀英

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江农业经济职业学院制药工程系，黑龙江 牡丹江 157000；3.东北农业大学医院，黑龙江 哈尔滨 150030）

中药大黄（Rheum tanguticum Maxim.）为蓼科植物的根茎，成分丰富，20世纪大黄的研究主要集中于蒽类，近年研究发现，曾被忽视的成分大黄多糖（rheum tanguticum polysaccharide，RTP）具有广泛的生物活性，大黄多糖具有降血糖、治疗结肠炎、脑保护、抗肿瘤、增强免疫力及降低细胞内游离钙离子浓度的作用。但大黄多糖提取优化工艺的试验报道少，超声波提取工艺的试验仍为空白，并且其抗病毒活性研究报道也甚少。新城疫是对养鸡业危害较严重的传染病之一，给养禽业造成了严重的经济损失，而目前能有效低毒的防治新城疫病毒性疾病的药物缺乏。本试验以大黄多糖为研究对象，对大黄多糖超声波法提取工艺进行优化，并对纯化后大黄多糖的抗新城疫病毒活性进行观察试验，确定了大黄多糖最佳提取工艺，为防治新城疫病毒性疾病提供科学依据，报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与病毒 唐古特大黄购于哈尔滨世一堂药店；病毒唑购于东北制药总厂；所用试剂均为国产分析纯；F9E48新城疫病毒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽病实验室提供；9周龄SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2 多糖含量测定方法［1］采用苯酚-硫酸法对多糖含量进行测定，多糖提取率及含量的换算公式如下：

多糖占粗提物的比率（多糖提取率）=糖重量（经OD值换算）／多糖测样质量×100%

中药中多糖含量（多糖含量）=多糖提取率×提取粗多糖重量／中药总重量×100%

1.3 传统法提取大黄多糖 准确称取5g大黄（大黄提取前需经干燥粉碎，回流提取，过滤干燥处理），分3次加蒸馏水达样品量的20倍、10倍、10倍，各蒸煮1h，合并提取液过滤、浓缩和醇沉，干燥得大黄多糖，称重，计算多糖提取率和多糖含量。

1.4 大黄多糖超声波法提取工艺的优化 以提取时间、温度、料液比、pH 值为单因素考察对象（表1），以多糖含量及多糖提取率为多糖提取效果指标，优化超声波法提取大黄多糖的单因素参数。采用正交试验法优化提取工艺（表2）。将最优提取参数下大黄多糖提取与传统提取方法比较。

表1 单因素考察

表2 正交设计试验因素水平

1.5 大黄多糖抗新城疫病毒活性检测 本试验选择体外跟踪法，以鸡胚成纤维细胞为平台对大黄多糖抗新城疫病毒进行研究，细胞培养方法参照殷震［2］，接种倍比稀释NDV病毒液，培养，观察记录，根据Reed-Muench公式计算TCID50值。

设定两种加药方式，先加大黄多糖再作用病毒组与先作用病毒后加多糖组，测定多种多糖对新城疫病毒的影响。细胞病变（CPE）、紫外吸光度值（OD值）及选择指数（TI）比较法综合评价抗病毒效果，TI=最大无毒浓度／最小有效浓度。

2 结果与分析

2.1 单因素对多糖提取的影响 见图1～4。

图1 提取时间的影响

2.2 超声波法正交设计试验结果 见表3～5。

表3 超声波法提取大黄多糖正交设计试验因素水平L9（34）

根据R值，影响多糖提取率及多糖含量的主次关系依次是温度（C）＞料液比（B）＞pH值（A）＞时间（D）；料液比（B）＞pH 值（A）＞温度（C）＞时间（D）。方差分析显示，B因素及A因素即料液比和pH值对多糖含量试验结果影响显著。综合考虑正交试验结果，推定超声波提取大黄多糖的最佳工艺条件是A3B3C1D2，即pH值为9.0，料液比为1∶40，温度为40℃，时间为50min。条件下提取率及多糖含量为42.27%，13.11%，均高于传统提取法38.10%，5.06%。

表4 超声波法提取正交试验结果

表5 超声波法正交试验方差分析

2.3 大黄多糖抗NDV作用结果

2.3.1 TCID50与大黄多糖安全浓度 NDV的TCID50为10-6.56，大黄多糖的安全浓度为1mg／mL。

2.3.2 大黄多糖抗NDV活性结果 大黄多糖抗NDV活性的细胞病变观察结果与MTT测定结果一致，多糖浓度为1／21mg／mL，抗病毒作用最大，与病毒对照组差异极显著（P＜0.01），抗NDV活性低于阳性对照药，治疗指数均达4，体外试验表现一定细胞保护作用和抗NDV作用（见表6）。

3 讨论

根据大黄药材目的多糖高温易变性的特点，通过先粉碎中药再超声波提取的方法，可低成本获得高含量、高稳定性、低杂质的大黄多糖。试验发现，通过调节提取液酸碱度可促进大黄多糖的浸出，碱度越大，大黄多糖含量越高，结合赵燕等［3］阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸5种单糖组成推测，此现象是由于大黄多糖中含有糖醛酸及酸性多糖所导致，但碱浓度过高会导致有些多糖在水解，不利于活性的研究。试验发现，多糖颜色与提取pH值呈正相关，pH值越大颜色越深，这是由于大黄色素更易溶于碱性溶液中，pH值的增高促进了大黄中色素的溶解，增加了后期除色素的困难。

表6 RTP和sRTP各组细胞CPE和OD值的变化

超声波提取大黄多糖的最佳工艺条件为pH值9.0，料液比1∶40，温度40℃，时间50min，这一推定参数没在正交试验表中，后经验证，参数下提取大黄多糖提取率及多糖含量为42.27%，13.11%，均高于正交试验组与传统法提取组。传统法获得数据38.10%，5.06%，与倪受东［4］研究中多糖含量6.54%接近。超声波法优于纪耀华等［5］研究的微波法提取大黄多糖的工艺，微波法大黄多糖的最佳工艺条件为提取时间3min，微波功率400W，料液比1∶10，pH值为10。

大黄多糖抗NDV活性试验，根据新城疫病毒性疾病的发病特点，结合可能出现的用药时机，排除了中药与病毒自然环境下作用后再作用细胞的临床发生可能，设定两种给药方式，一种先加大黄多糖作用12h，再加入病毒吸附作用，目的是观察药物能否进入细胞或吸附于细胞表面，以阻止病毒的吸附与侵入［6］，另一种先加病毒吸附作用后，再加入大黄多糖，目的是观察药物能否对已进入细胞内的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟释放［6］。通过MTT检测细胞活性结合CPE的方法发现，大黄多糖在两种作用方式下对DNV均有抑制作用，先加多糖组抗NDV活性略高于先加病毒组，治疗指数均为4，高于抗病毒药物研究效果评价中治疗指数大于2的标准。这两种加药方式从不同侧面探讨了中药的直接抗病毒机理，结果表明大黄多糖在这两种抗病毒途径中均发挥了较好的作用，关于大黄多糖抗NDV研究的仍无报道，但与任宇皓等［7］人对黄芪多糖，淫羊藿多糖抗NDV活性评价比较，大黄多糖抗NDV的治疗指数4高于黄芪、淫羊藿多糖先加多糖组的3，说明大黄多糖体外抗NDV活性很高，具有研究价值。

［1］张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］.杭州：浙江大学出版社，1999.

［2］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.3版.北京：北京科学出版社，1997.

［3］赵燕，刘莉，杨兴斌，等.中药大黄多糖中单糖组成的毛细管区带电泳分析［J］.分析化学研究简报，2006（34）：255-258.

［4］倪受东，严德江，徐先祥.大黄多糖的提取及含量测定［J］.中国药业，2007，16（13）：10-13.

［5］纪耀华，纪跃芝，马爱民，等.微波法提取大黄多糖最佳工艺优化研究［J］.中药材，2009，9：118-120.

［6］李凡，易世红，赵春艳，等.双黄连粉针剂抗病毒作用［J］.中草药，2002，33（1）：52-54.

［7］任宇皓，胡元亮.黄芪多糖、淫羊霍多糖和淫羊藿总黄酮对NDV，IBDV活性的研究［D］.南京：南京农业大学，2000.