框镜鲤维氏气单胞菌溶血素基因片段的克隆与序列分析

单晓枫，郭伟生，吴同垒，王伟利，钱爱东

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林进出口检验检疫局，吉林 长春 130062）

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii，AV）属于弧菌科、气单胞菌属，其广泛分布于水体和陆地，可导致人食物中毒，引发胃肠炎、腹膜炎、败血症、脑膜炎等疾病［1-2］；此外，该菌还可引起各种水产动物的不同疾病的暴发，如框镜鲤败血症、青虾软壳综合征、鱼的流行性溃疡综合征等等［3-5］。维氏气单胞菌可产生一系列的毒力因子，如气溶素、溶血素、胞外蛋白酶、内毒素、粘附素等。其中溶血素（hemolysin，hly）是基因组DNA编码的毒力因子，其聚合后插到细胞膜上，形成通道，导致溶血。但有关维氏气单胞菌溶血素的研究并不充分，有许多研究甚至将气溶素与溶血素混为一谈，目前，GenBank上尚未见维氏气单胞菌溶血素的全基因序列。鉴于此，本试验依据不同气单胞菌属菌种的溶血素基因，设计1对特异性引物，克隆了维氏气单胞菌的溶血素基因片段，并对其编码蛋白进行相关分析，以期为研究维氏气单胞菌溶血素在致病、毒力诱导免疫保护，以及建立特异性免疫学检测方法等方面建立基础。

1 材料与方法

1.1 菌种 维氏气单胞菌CY0806，分离于吉林省某渔场框镜鲤，经生理生化、16SrRNA序列分析，鉴定为维氏气单胞菌，由吉林农业大学预防兽医学研究室保存；基因工程菌E.coli DH5α，由本实验室保存制备；pMD18-T载体，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 主要试剂 DL-～Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP，均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自爱思进生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒小量抽提试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；气单胞菌培养基RS，购自北京陆桥技术有限责任公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 溶血活性检测 将维氏气单胞菌CY0806划线接种于1%兔血平板，30℃培养24h，观察其溶血活性。

1.4 引物设计与合成 根据GenBank报道的气单胞菌属不同菌种的溶血素基因，用生物软件Primer Premer 5.0设计一对特异性引物，上游引物P1：5′-GCGGAATTCATGCAAAAACTAAAAA-3′，下游引物 P2：5′-ATCAAGCTTTTAAAACTGGCTCTCGGC-3′。引物由宝生物工程（大连）有限公司。

1.5 维氏气单胞菌hly基因片段的PCR扩增 以维氏气单胞菌CY0806株基因组DNA为模板，P1、P2为引物，采用50μL反应体系进行PCR。反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性40s，48℃复性40s，72℃延伸80s，共34循环；72℃10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带用凝胶回收试剂盒纯化回收。

1.6 目的基因的克隆与鉴定 将回收产物与pMD18-T载体连接后，转化至DH5α感受态细胞中，在含氨苄青霉素培养基平板上37℃培养12～16 h，挑取单个菌落，增菌，提取质粒，以此为模板进行PCR鉴定。将阳性重组质粒送至宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.7 序列分析与结构预测 利用相关生物信息学软件或网站，将克隆基因片段的同源性、遗传演化关系、编码蛋白的二级结构、B细胞康威进行分析和预测。

2 结果

2.1 溶血性分析 菌株CY0806在血平板上出现明显的溶血圈，为β-溶血。

2.2 目的基因的PCR扩增与鉴定 用P1、P2引物对维氏气单胞菌CY0806溶血素基因片段进行扩增，获得一条与目的片段大小相符的条带（图1）；以阳性重组质粒为模板，通过PCR得到约400bp的片段，表明溶血素基因已成功克隆于载体中。

图1 维氏气单胞菌hly基因的PCR扩增

2.3 目的基因的序列分析及系统进化树构建 经序列测定，扩增出的基因片段长432bp，编码137个氨基酸，相对分子量15768.75u，含有17个强碱性氨基酸（K、R）、13个强酸性氨基酸（D、E）、45个疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）、40个极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）。

在NCBI上检索并下载不同菌种的溶血素基因，用Mega4.0软件与菌株CY0806溶血素基因片段构建系统进化树（图2）。分析显示，菌株CY0806溶血素基因片段与气单胞菌属菌种处于同一分支，同源性在95%以上。

2.4 目的基因编码蛋白的二级结构预测 以Garmier-Robson方法预测蛋白质的二级结构发现，α螺旋占38.4%，β折叠占5.07%，β转角占28.3%，无规则蜷曲占29.7%；而通过Chou-Fosman分析：α螺旋占26.1%，β折叠占21.7%，β转角占40.6%（图3）。

2.5 B细胞表位预测 以Kyte-Doolittle的氨基酸亲水预测结果、Emini的蛋白表面可及性预测结果、Chou-Fasman方案的β转角分析结果、Karplus-Sohulz的原则预测柔性蛋白结果，综合分析预测，得到以下四个区域：5～10、48～52、99～104、126～130可能形成B细胞表位。

3 讨论

维氏气单胞菌是近年来新型的人-兽-鱼共患病原菌，其可感染人并引发多种疾病；此外，也可危害大部分淡水鱼类、虾、蟹等水生动物。而溶血素是气单胞菌的主要致病因子之一，其毒力作用与其结构密切相关，研究表明，溶血素具有水溶性跨膜毒素的特征--溶血素N端可与三段β折叠的溶血素结构组成一个“门闩”结构［6-7］。本试验克隆的溶血素基因虽然只是一个片段，但二级结构分析表明，此片段存在β折叠，至于是否能形成“门闩”结构，还需用其他方法扩增出溶血素全长序列，推导出三级结构验证。

本试验克隆到框镜鲤维氏气单胞菌分离株CY0806的溶血素基因片段，其序列与气单胞菌属不同菌种有着较高的同源性（95%以上），但与大肠杆菌、弧菌等溶血素同源性较低，说明气单胞菌属内各菌种的溶血素基因可能有着相同起源，为寻找气单胞菌共同抗原提供帮助。

蛋白质的亲水性、柔韧性、β转角、表面可及性等在抗原的形成方面发挥着重要作用，本试验综合了不同参数，预测该溶血素片段有4个氨基酸区域指标达到抗原区标准，说明溶血素具有很好的抗原性。

本试验成功的克隆了维氏气单胞菌CY0806株的溶血素基因片段，并对其同源性、编码蛋白的二级结构、B细胞表位进行预测分析，结果为维氏气单胞菌溶血素全长基因的扩增、其作为基因工程疫苗的候选抗原，以及维氏气单胞菌特异性免疫学检测方法的建立奠定了基础。

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［5］Rahman M，Colque-Navarro P，Khn I，et al.Identification and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh［J］.Applied Environmental Microbiology，2002，68（2）：650-655.

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