弓形虫单基因和复合基因疫苗的研究进展＊

刘秀华，李英豪，苑文英，藏爱民，田因诗，余瑞欣，周雅静

2.保定市妇幼保健院

弓形虫（Toxoplasmagondii）为专性细胞内寄生原虫，全球分布，能引起人兽共患寄生虫病，全世界的感染率为34%，大多数为隐性感染，孕妇感染常引起流产、畸胎、死胎，对于肿瘤患者或AIDS病人等免疫功能受损者，弓形虫是引起死亡的主要原因之一。此外，弓形虫病也给畜牧业生产造成严重的经济损失。迄今尚无治疗弓形虫病的特效药，因此研制安全有效的疫苗极为迫切。由于弓形虫生活史较复杂，抗原成分具有发育阶段的特异性或差异性，因此发展多种抗原组合、针对不同生活史发育阶段的复合多价疫苗是研究弓形虫疫苗过程中的一个发展方向与共识。具有免疫保护性抗原基因的获得是基因疫苗研制的基础工作。已发现的具有免疫保护性抗原基因，主要集中在（1）弓形虫表面抗原（SAG）基因；（2）致密颗粒（GRA）基因（3）i虫体棒状体蛋白（ROP）基因；（4）微线体蛋白（MIC）基因等候选分子上。

1 表面抗原

1.1 SAG1 作为弓形虫速殖子表面的主要抗原之一，是迄今应用最多的弓形虫疫苗候选抗原。SAG1蛋白分布于弓形虫速殖子表膜、速殖子内以及纳虫泡的管状结构中，约占弓形虫体总蛋白的3%～5%，却可抑制患者血清中抗体活性的50%，说明SAG1含量虽微，却是速殖子的主要抗原成份，是诱导宿主免疫应答的主要靶抗原。能够诱导机体产生IgG，Ig M，IgE，Ig A及sIg A，抗SAG1抗体在体外有杀虫、体内有保护作用，并可诱导产生一些细胞因子，如γ－干扰素和细胞毒性淋巴因子，其抗原特异性的CD＋8T细胞能直接杀伤细胞外弓形虫，对弓形虫感染的腹腔巨噬细胞亦具有细胞毒性。

1.2 SAG2可使弓形虫固定于有核细胞的表面，并辅助弓形虫进入有核细胞，介导弓形虫速殖子的入侵过程。抗SAG2蛋白抗体也可以阻断弓形虫的再定位，还有可能在弓形虫速殖子向缓殖子转化过程中起作用。SAG2也具有一定的免疫诱导作用，有高世同等［1］研究表明，用编码SAG2的基因构建真核表达质粒PBK/SAG2，免疫接种BALB/c小鼠，5周后，取鼠脾细胞作Con A刺激淋转实验及T细胞亚群测定，结果CD＋8T细胞明显增多，显示SAG2蛋白可刺激机体的细胞免疫应答。

1.3 SAG3最长编码有385个氨基酸残基，它含有一个疏水的NH2末端及一个GPI锚定位点，它在速殖子、缓殖子及子孢子等多个时期均有表达。最新研究表明SAG3的主要功能是参与虫体的增殖，但在弓形虫入侵和增殖的过程中，SAG3究竟起了什么作用，目前并不清楚［1］。

1.4 SAG4由516个核苷酸编码的大小为172个氨基酸的表面蛋白组成，分子量为18 k D，N端疏水区为27个氨基酸的信号肽，C末端疏水区为GPI锚定信号。

2 棒状体蛋白

2.1 ROP1在侵入宿主细胞的早期影响宿主细胞的通透性。ROP1基因具高度保守性，体外扩增出的弓形虫RH、ZS1、ZS2及GT14虫株的ROP1的基因片段，大小为756 bp，虫株间未见明显差异。

2.2 ROP2主要协助虫体入侵宿主细胞，在弓形虫生活史的速殖子期、缓殖子期和子抱子期中均有表达，具有高度的保守性和免疫原性。Saavedral等研究ROP2抗原中被T细胞识别表位时发现，弓形虫ROP2抗原包含有被多数免疫个体所识别的T细胞表位（197－216、393－410、501－524）；表位识别试验结果显示，多肽197－216能被45%弓形虫患者的外周血单核细胞所识别，多肽501－524能被36%患者的外周血单核细胞所识别，多肽393－410的识别率为9%，且三者都不能被弓形虫病阴性健康者所识别，说明它有作为疫苗候选因子的巨大潜力。在vercammen M［3］等的研究中，含ROP2的重组质粒可刺激小鼠产生部分保护效果，且可使C3H系小鼠抵抗致死性经口弓形虫感染。

3 致密颗粒蛋白

GRA在宿主与寄生虫的相互作用中起重要作用，对人体和动物具有较强的免疫反应性和免疫原性，在弓形虫病诊断和免疫预防的研究中受到广泛关注。

3.1 GRA2分子量为28.5 k Da，在编码区有一个内含子，内部存在螺旋结构，为两个不同性质的α－螺旋。其抗原性很强，用纯化的GRA2免疫小鼠，抗攻击感染的小鼠存活率为75%。目前研究表明GRA2在急慢性弓形虫感染血清中普遍存在，至少存在3个B细胞表位和1个T细胞表位，可诱发机体产生IgG，Ig M，Ig A多种抗体，激活GRA2特异性的CD＋4T细胞，诱导机体的保护性免疫。

3.2 GRA 3基因为单拷贝，其cDNA在N一末端编码2个蛋氨酸，相邻有1个开放阅读框。富含脯氨酸，不含内含子，在体内的转录水平很高，可用于弓形虫病的诊断和作为疫苗的候选分子。薛书江等［4］成功建立了真核表达质粒p VAX－GRA3，并采用阳离子脂质体将p VAX－GRA3质粒DNA转入Hela细胞。RT－PCR检测结果显示，GRA3基因在Hela细胞中得到有效转录，表明阳离子脂质体成功地将p VAX－GRA3转入靶细胞。而GRA 3基因的表达蛋白是否具有较好的反应原性和免疫原性，还需进一步探讨。

3.3 GRA7 Velmurugan等［5］在大肠埃希菌中重组表达了弓形虫GRA7，免疫印迹和酶联免疫吸附测定证明重组GRA7具有良好的反应原性，可用于弓形虫急性感染的诊断。Sadeghiani等［6］重组表达了弓形虫GRA7，免疫印迹分析表明重组GRA7能与弓形虫急性感染人血清反应，与慢性感染血清反应弱，阴性血清无反应，提示重组GRA7可用于研制弓形虫感染的诊断试剂盒。皮内免疫GRA1和GRA7 DNA疫苗混合物产生高滴度的抗GRA1、GRA7及弓形虫裂解产物的抗体，攻击感染后检测到淋巴细胞增殖和IFN－γ生成，提示DNA疫苗可有效抵抗弓形虫感染［7］。这些研究已证明，弓形虫GRA7是弓形虫病的一种重要诊断抗原和疫苗候选抗原。

4 微线体蛋白

目前已知的微线体蛋白有15种以上，包括MIC1－MIC12、AMA1、Tg－SUB1、Tg－SUB2等，大多含有类似真核细胞黏附分子的保守结构域，如血小板结合蛋白样结构域、整合素A样结构域、表皮生长因子样结构域、几丁质连接样结构域和苹果样基序等。

4.1 MIC3是一种大小为90 k D蛋白，参与虫体与宿主细胞间的黏附过程，且在弓形虫速殖子、缓殖子和子孢子3个感染阶段都有表达。MIC3在早期能够诱导小鼠和人分泌高效价的IgG抗体以及IFN－γ、IL－2、IL－4和IL－10等细胞因子，使机体产生高强度的体液免疫和细胞免疫应答，作为疫苗候选分子具有巨大的潜力。

4.2 MIC4在弓形虫生活史的所有感染阶段中均有表达，基因全长1 743bp，无内含子，单拷贝。与宿主细胞相连，其C端的App6结构具有黏附功能。Beghetto［8］等构建了含MIC4等5种微线体基因片断的质粒，经研究表明此质粒产生了很好的免疫保护性，预示着MIC4作为一种疫苗组分的可行性。同样，在Lourenco［9］等的研究中，MIC4亦触发了良好的免疫反应，促使机体多种细胞因子如IL－2，IL－12，IFN－γ，IL－10等水平上升。

4.3 MIC8是一个单基因拷贝序列，无内含子，它所编码的蛋白是MIC3蛋白的护送蛋白，在速殖子和缓殖子期都有表达，可帮助MIC3蛋白到达微线体并分泌出胞。Meissner等用EGF样结构域序列搜索刚地弓形虫表达序列标数据库，发现MIC8含有一个几丁质样区和十个EGF样结构域。EGF结构域是表皮生长因子序列内部的功能域，而许多蛋白也有EGF样结构域，它们与EGF的氨基酸序列和受体识别能力相似并执行类似的功能。EGF受体是启动酪氨酸激酶信号传导通路的重要分子，在很多细胞都有表达。EGF与受体结合后可激活受体蛋白酪氨酸激酶，进而激活一系列反应，最终导致合成RNA，蛋白质和脂类，复制DNA，细胞分裂。EGF/EGFR可能是低免疫人群对弓形虫易感的重要分子基础之一。MIC8作为微线体蛋白中EGF样结构域含量较高者，很有可能在弓形虫粘附宿主细胞的过程中起着重要的作用。最新研究表明，当MIC8不存在的时候，虫体不能与宿主细胞形成接触融合区域，使得侵入宿主细胞过程受阻，这种由MIC8参与形成的细胞融合区域非常重要，不可被其他的微线体蛋白来替代，从而表明MIC8是一种新颖的，功能独特的蛋白。另外，MIC8参与的信号级放大反应，也与棒状体蛋白的分泌有关［10］。

4.4 AMA1是弓形虫的一个重要抗原，与虫体入侵宿主细胞的功能密切相关，从弓形虫基因组中敲除AMA1基因，可明显降低弓形虫对宿主细胞的入侵能力。AMA1是保守的抗原蛋白［11］，能诱导特异性的Th1型免疫应答，是最有希望的抗弓形虫感染的候选疫苗之一。利用脂质体将pcDNA3.1－AMA1导入真核细胞人胚胎肾细胞（HEK293细胞）中，经 Western blotting鉴定，AMA1基因在HEK293细胞中成功表达，并且能被特异性重组蛋白免疫血清所识别，说明AMA1蛋白在体外表达后具有一定的免疫活性，从而为进一步应用AMA1－DNA疫苗免疫试验动物和鉴定DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。

5 复合基因疫苗

5.1 RH 株 弓 形 虫 复 合 基 因 质 粒pc DNA3.1－SAG1－ROP2－GRA2［12］，并验证重组质粒在 Hela细胞中的表达后，以肌注方式接种BALB/c小鼠，测定血清中IgG的量、免疫小鼠脾细胞上清液中细胞因子的浓度及淋巴转化实验的结果，并用RH株弓形虫速殖子对免疫小鼠进行攻击感染实验。动物实验结果显示，该质粒诱发机体的全面免疫应答，免疫动物产生高浓度的IgG抗体，细胞免疫呈Th1型，分泌INF－γ，而无IL－4产生，淋巴细胞转化实验及NK细胞杀伤实验表明集体的非特异性免疫水平也有所提高，免疫小鼠能延长感染后小鼠的生存时间。质粒pcDNA3.1－SAG1－ROP2－GRA2的免疫效果优于 pcDNA3.1－SAG1－ROP2 及 pcDNA3.1－SAG1－GRA2。mIL－12对该基因的免疫效果起了很好的增强作用。

5.2 赵红［13］采用弓形虫速殖子表面抗原SAG1与ROP2基因定向连接并构建在同一真核表达载体，通过滴鼻粘膜免疫小鼠，LTB作为免疫佐剂增强免疫效果。结果显示，弓形虫速殖子复合基因疫苗pcDNA3.1－SAG1－ROP2 质 粒 和 p EASY－E1－LTB质粒共同免疫较复合基因疫苗单独免疫具有更好的免疫效果，其不仅能刺激机体产生较强的系统免疫应答，而且也可诱导机体产生较强的局部黏膜免疫应答。

5.3 姚远［14］通过基因重组构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1－SAG1－MIC8，与 单 基 因 质 粒 pcDNA3.1－SAG1及pcDNA3.1－MIC8免疫小鼠，以研究复合基因疫苗效果。实验中复合基因组总IgG抗体、特异性IgG抗体及细胞因子IFN－γ的数量均高于单基因免疫组，验证了复合基因疫苗较之单基因疫苗具有更好的免疫效果。

6 猜 想

SAG1、ROP2和GRA2三者的复合基因疫苗、SAG1和ROP 2二者的复合基因疫苗及SAG1和MIC8二者的复合基因疫苗均比各自组成成分的单基因疫苗有更好的免疫效果。而MIC8参与形成的细胞融合区域非常重要，不可被其他的微线体蛋白来替代，也与棒状体蛋白的分泌有关。由此猜测SAG1－ROP2－MIC8复合基因疫苗对弓形虫具有更好的免疫效果。

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