副结核病诊断抗原研究进展＊

徐凤宇，姜秀云，么乃全，钱爱东

2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春 130118；

3.吉林农业大学生命科学学院，长春 130118

副结核病是由禽分枝杆菌副结核亚种（Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis，MAP）引起的多种动物共患的慢性、肠道肉芽肿性传染病，也称Johne＇s病，呈世界性分布，在我国被列入二类动物疫病。调查表明，美国大约20%～40%的奶牛群感染MAP，常导致产奶量下降及体重减轻，每头感染牛每年的损失约＄227［1］。由于目前针对该病的疫苗存在干扰检疫等缺点，所以根除的最好办法是尽早检出、隔离或淘汰病畜。该病原的检测方法有多种，如直接镜检、分离培养、分子生物学检测、噬菌体生物扩增技术等［2］，但这些方法或敏感性不高，或耗时长，且在疾病的亚临床阶段揭发率较低，而恰恰该病的亚临床期较长，所以降低了以上方法在临床诊断中的应用价值。血清学方法和迟发型过敏反应可快速、有效地诊断该病，有些方法能检出亚临床病例［3］，但目前这些以抗原为基础的检测方法所用抗原多为复合物，与其它分枝杆菌存在交叉反应，而环境中的腐生分枝杆菌等又常侵袭动物，所以使用复合抗原检测的特异性不高，限制了其在临床检测中的应用。所以，近年很多研究与优化诊断抗原相关，随着该病原基因组全序列的揭晓，这项工作的进程也在加快，特综述之。

1 复合抗原

为提高副结核病诊断的特异性，有学者对MAP的蛋白组分进行了研究。Cho等［4］比较了该菌产生的培养滤液（culture filtrates，CF）和细胞提取液（cellular extracts，CE）的蛋白质组，研究了二者的抗原性，发现CE蛋白分子量范围较宽，有的蛋白达100 ku，而多数CF蛋白分子量小于50 ku；二维电泳结果表明：CF蛋白的等电点（pI值）很窄，多为p H 4.0～5.5，CE蛋白的pI值为p H 4.0～7.0；用MAP自然感染的牛血清进行免疫印迹分析，与血清发生反应的CF蛋白较多，暗示进行血清学检测时，可用CF代替CE；但即使是以CF蛋白为抗原，也不能检测所有的MAP阳性牛，尤其是在感染早期未产生足够的抗体应答时。在此基础上，该课题组以MAP JTC303株CF蛋白为抗原，将待检牛血清、牛奶用草分枝杆菌的细胞提取物吸收去除其中的交叉抗体，建立了JTC－ELISA方法，与5个商业ELISA试剂盒相比，诊断的敏感性明显提高，特异性也很稳定，尤其在粪排菌率较低的病例中应用效果更好，敏感性为40%，而商业试剂盒的敏感性为20%［5］。我国何昭阳等［6］采用除去草分枝杆菌抗原或其类属抗原的办法，制备了亲和层析抗原和草柱亲和抗原，建立的ELISA检测方法表现出了良好的特异性，其中草柱亲和抗原制备更容易，收获量多，有利于大批量生产应用，将其应用于临床中效果非常好，尤其适用于消除PPD－ELISA产生的假阳性反应。

2 特异抗原

2.1 细胞免疫诊断抗原

2.1.1 Ag85复合物 作为分枝酰转移酶家族，Ag85复合物存在于MAP培养滤液中，大小约30～32 ku。一方面，它是MAP、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌等的保护性抗原，亚单位疫苗的候选抗原之一；另一方面，它能有效增强MAP感染10周左右的牛产生体外IFN－γ应答，其中Ag85A（MAP 0216）和Ag85B（MAP 1609c）合成肽作用强于Ag85C（MAP 3531c）；用实验感染牛鉴定发现，Ag85B的T细胞表位在第145～162个氨基酸之间；应用重组并纯化的Ag85A和Ag85B检测感染MAP的犊牛会产生增殖反应，作为T细胞抗原可以早期识别自然感染牛［7］。

2.1.2 MAP1204和 MAP1087 Bannantine等［1］分析了92个重组的MAP蛋白（包括Ag85复合物），发现有两个可能的抗原很适合作为副结核病牛的早期（感染后70天）检测，这两个蛋白分别由MAP1087和MAP1204编码，大小分别为146、244个氨基酸，且两个蛋白联合应用能检测出更多的亚临床病牛，为该病的早期诊断提供了思路。

2.1.3 MAP41 2005 年，Nagata 等［8］获 得 了MAP10、MAP39和MAP41（后两者为PPE家族成员，分别由MAP3184、MAP1518基因编码）的核苷酸序列，并用大肠杆菌表达了此三种蛋白，发现它们能增强MAP感染牛外周血单核细胞产生IFN－γ的能力。一般而言，感染MAP的牛血细胞在用MAP抗原刺激后会产生大量IL－10，从而抑制T细胞产生IFN－γ，可以作为重要的诊断指标。2010年，该研究者［9］发现MAP41可诱导接种MAP两周后的实验牛产生IL－10，检出的时间早于IFN－γ，产生的量高于其他分枝杆菌感染的牛，在以豚鼠为实验动物时也得到了相似的结果。此研究表明，MAP41检测IL－10水平可以作为一种有效的检测方法，而且能提前检出时间，减少带菌动物排菌污染环境并对其他动物及人类造成的威胁，有利于更好地控制副结核病。

2.2 体液免疫诊断抗原

2.2.1 34 ku蛋白 34 ku蛋白的编码基因是从MAP的λgt11文库中筛选到的，该基因包含三部分。最初的研究表明，其编码的13.6 ku羧基端（a362）与所有检测的MAP发生反应而不与其它20株菌包括禽分枝亚种禽亚种（MAA）和胞内分枝杆菌发生反应。免疫电镜观察发现在MAP表面存在a362多肽，用重组的a362多肽作ELISA抗原，结果能对所有检测的感染牛及疾病所有阶段的血样准确分析，认为该蛋白的羧基端含有种特异性表位，曾被用于牛副结核病的ELISA特异性诊断中。但是，2007年 Malamo等［10］制备了a362的单克隆抗体（MAbs），在ELISA和免疫印迹实验中，2株单抗均与MAA、胞内分枝杆菌发生交叉反应，重组蛋白也与3种分枝杆菌的兔多克隆抗体发生反应，表明该蛋白羧基端有MAP、MAA及胞内分枝杆菌共有的抗原决定簇，在自然感染牛体内很容易诱导抗体产生，共有决定簇降低了34 ku蛋白的羧基端用于诊断的特异性。

另外，Willemsen等［11］发现9、15和34 ku蛋白（分别由MAP2609、MAP2942c和MAP0210c编码）与结核杆菌的TB8.4、MPT53和Erp抗原具有很高的同源性，且都能被临床或亚临床感染牛的抗体识别，三者均为分泌抗原，可能被用作诊断抗原。经过氨基酸序列比较，此处的34 ku蛋白与前述的34 ku并非同一物质。

2.2.2 35 ku抗原 Zaatari等［12］克隆并表达了分子量35 ku的抗原（p35 Ag），发现编码此蛋白的基因（p35）只与禽分枝杆菌复合群的DNA杂交。用感染或未感染的57只动物参考血清进行免疫印迹，发现它能100%识别处于临床期动物（12头牛、2只山羊和2只绵羊）的血清，对处于亚临床阶段的20头牛的血清识别率为75%，而15头非MAP感染奶牛、3头BCG接种的牛、3头人工大剂量接种MAP的奶牛血清不能被p35 Ag识别。总的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为86%、100%、100%和75%，p35 Ag免疫印迹的准确率超过了当时商业上可用的诊断Johne＇s病的方法，推测其可用于副结核病的诊断，其编码基因可作成探针等用于禽分枝杆菌复合群诊断。

2.2.3 MAP0862 等 Paustian 等［13］通 过 分 析MAP的基因组，鉴定了13个ORF。纯化其中的5种蛋白，用其与自然感染的牛、暴露于MAP的鼠和兔的血清进行免疫印迹分析，发现其中MAP0862、MAP3732c和MAP2963c几乎可以被所有的病牛血清识别；进一步分析MAP0862，发现其只与感染牛血清发生反应，初步确定了其在诊断中的意义。Bannantine等［14］在改进检测羊副结核病的ELISA研究中发现，用重组蛋白MAP0862和MAP3786做抗原时产生的免疫反应较强，MAP0862能检出81%的 MAP感染羊。国内迟磊等［15］扩增了MAP0862和MAP2154c，并进行诱导融合表达，得到了76 ku的重组蛋白MAP0862/2154c，为其在诊断中的应用奠定了基础。

2.2.4 MAP0865和 MAP1637c Leroy等［16］应用生物信息学工具，从MAP的基因组中筛选出87个MAP特有的序列，通过抗原性分析选择3个具有免疫原性的基因，应用重组纯化抗原建立的ELISA检测方法表明，有两个抗原特异性高于商品化的试剂盒，达到98%（后者为92%），敏感性达分别为72%和82%，前者与 MAP0865有关，被作者命名为Ag6，后者为MAP1637c。生物信息学方法的应用为寻找侯选抗原提供了思路。

2.2.5 MAP1272c和 MAP2121c等 Li等［17］等用重组表达的MAP1272c和MAP2121c作为抗原，建立了ELISA方法，对7份阳性血清进行检测，发现前者能检出7份，后者为能检出5份，显示了MAP1272c在血清学诊断方面的潜在价值。Bannantine等［18］（2008年）对43个 MAP重组蛋白进行了研究，表明除 MAP3155c能与Johne＇s病牛血清发生强烈的免疫反应外，Dna K（Hsp70）、MAP2121c能被免疫的鼠和兔血清识别。

Bannantine等［19］建立了检测血清中MAP抗体的蛋白微阵列，93个重组蛋白被点到硝酸纤维素上，采用健康、牛分枝杆菌感染、MAA感染牛血清鉴定这些蛋白的非特异性，结果表明与MAA感染牛血清交叉反应更强；后又应用自然或实验感染牛血清识别这些抗原，结果检测到3个膜蛋白与Johne＇s牛血清发生最强烈的反应，它们是侵袭蛋白、ABC肽运输透明质酸酶和假定的鸟苷三磷酸蛋白。

［1］Bannantine J P，Bayles DO，Waters W R，et al.Early antibody response againstMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisantigen in subclinical cattle［J］.Proteome Sci，2008，28：（6）：5.

［2］徐凤宇，姜秀云，么乃全，等.禽分枝杆菌副结核亚种检测方法研究进展［J］.中国预防兽医学报，2010，32，（4）：325－328.

［3］WHO.哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册［M］.北京：中国农业科学技术出版社，2002：273－284.

［4］Donghee Cho，Michael T.Collins.et al.Comparison of the Proteosomes and Antigenicities of Secreted and Cellular Proteins Produced byMycobacteriumparatuberculosis［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2006，13（10）：1155－1161.

［5］Sung J S，Donghee C，Michael T.Collins.Diagnosis of Bovine Paratuberculosis by a Novel Enzyme－Linked Immunosorbent Assay Based on Early Secreted Antigens ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2008，15（8）：1277－1281.

［6］何昭阳，顾万钧，钱爱东等.副结核ELISA中两种亲和抗原的比较［J］.中国畜禽传染病，1990，51（2）：31－32.

［7］Valérie Rosseels，Sylvie Marché，Virginie Roupie，et al.Members of the 30－to 32－Kilodalton Mycolyl Transferase Family（Ag85）from Culture Filtrate ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisAre Immunodominant Th1－Type Antigens Recognized Early upon Infection in Mice and Cattle［J］.Infection and Immunity，2006，74（1）：202－212.

［8］Reiko N，Yoshihiro M，Kazuhiro Y，et al.Expression Cloning of Gamma Interferon－Inducing Antigens ofMycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis［J］.Infection and Immunity，2005，73（6）：3778－3782.

［9］Reiko N，Satoko K，Yuu M，et al.A specific induction of interleukin－10 by the Map41 recombinant PPE antigen of Mycobacterium avium subsp.paratuberculos［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2010，135（1－2）：71－78.

［10］Malamo M，Okazaki K，Sakoda Y，et al.Carboxyl terminus of the 34 kDa protein ofMycobacteriumparatuberculosisshares homologous B－cell epitopes withMycobacteriumaviumand Mycobacteriumintracellulare［J］.The Veterinary Record，2007，161：853－857.

［11］Peter T J.Willemsen，Jos Westerveen，Annemieke Dinkla，et al.Secreted antigens ofMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisas prominent immune targets［J］.2006，114（3－4）：337－344.

［12］FA El－Zaatari，SA Naser，DY Graham.Characterization of a

specificMycobacteriumparatuberculosisrecombinant clone expressing 35，000－molecular－weight antigen and reactivity with sera from animals with clinical and subclinical Johne＇s disease［J］.Journal of Clinical Microbiology，1997，35（7）：1794－1799.［13］Michael L P，Alongkorn A，Vivek K，et al.Characterization of Novel Coding Sequences Specific toMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis：Implications for Diagnosis of Johne＇s Disease［J］.Journal of Clinical Microbiology，2004，42（6）：2675－2681.

［14］John P B，Valentina Rosu，Stefania Zanetti，et al.Antigenic profiles of recombinant proteins fromMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisin sheep with John/s disease［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology［J］.2008，122（1－2）：116－125.

［15］迟磊，刘思国，王春来，等.禽分枝杆菌副结核亚种map0862基因与map2154c基因的串联重组表达［J］.中国兽医科学，2008，38（10）：856－859.

［16］B.Leroy，S.Viart，N.Trinchero.et al.Use ofMycobacterium aviumsubsp.paratuberculosisspecific coding sequences for serodiagnosis of bovine paratuberculosis［J］.Veterinary Microbiology，2009，135：313－319.

［17］Lingling Li，Shirin Munir，John P.Bannantine，et al.Rapid Expression ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisRecombinant Proteins for Antigen Discovery［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2007，14（1）：102－105.

［18］Bannantine JP，Waters WR，Stabel JR，et al.Development and use of a partialMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisprotein array［J］.Proteomics.2008，8（3）：463－474.

［19］John P B，Michael L P，Waters W R，et al.Profiling Bovine Antibody Responses toMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisInfection by Using Protein Arrays［J］.Infection and Immunity，2008，76（2）：739－749.