弓形虫微线体蛋白MIC3的研究进展＊

江 涛

弓形虫（Toxoplasmagondii）的微线体（microneme）散布于虫体前端棒状体周围，是一种具有分泌功能的细胞器，其分泌的微线体蛋白（microneme proteins MICs）与虫体对宿主细胞的识别和结合密切相关，在虫体入侵宿主细胞早期发挥重要作用［1］。目前发现的微线体蛋白有15种以上，包括 MIC1－MIC12、AMA1、SUB1、SUB2等［2］，MIC3是其中重要的一种微线体蛋白。由于MIC3在弓形虫的速殖子、缓殖子和子孢子期都能表达，被认为是在弓形虫病的诊断和疫苗研制上非常有前景的候选分子［3－4］。

1 MIC3的结构

MIC3于1991年发现，Achbarou等［5］研究表明MIC3分子量约为90 k D，由2个38 k D的多肽组成，其等电点分别为6.75和6.70，均可被相同的单克隆抗体识别，认为2条多肽链是同源的，且通过二硫桥连接在一起。Garcia－Reguet等［6］首次对MIC3基因的碱基序列进行了鉴定分析，发现MIC3基因是单拷贝基因，不含内含子，ORF编码395个氨基酸残基的多肽，MIC3含有34个半胱氨酸，等电点为5.98，推导有12个磷酸化位点，1个潜在的N－糖基化氨基酸共有序列Asn－X－Ser/Thr位于肽链的201处，MIC3蛋白序列含有5个表皮生长因子样（epidermal growth factor－like，EGF）结构域和1个氨基端的类几丁质（chitin binding－like，CBL）模体。EGF1～EGF5分别位于aa118～159、147～189、190～236、237～290和263～343，其中EGF2－3串联排列，EGF1和EGF5分别与EGF2和EGF4部分重叠；CBL模体中含有8个能够形成二硫键的半胱氨酸和3个高度保守的芳香族残基。MIC3蛋白N端有一个26个氨基酸的疏水信号肽，无跨膜区域，应用Edman降解法对N－末端微序列进行分析发现，40个氨基酸的前肽序列位于信号肽序列切割点下游，显示MIC3在其生物合成期间必须进行加工处理，推导切除前肽和信号肽后的预测分子量与MIC3一个成熟亚单位的表观分子量（38 k D）非常吻合。Cérède等［3］进一步研究分析发现弓形虫速殖子体内的MIC3是一种90 k D的蛋白质。在分泌转运途径中及贮存前合成的是40 k D蛋白质前体，经蛋白酶水解成为38 k D终产物，并折叠成90 k D二聚体。将编码全长MIC3的核苷酸序列克隆入哺乳动物表达载体pcDNA3，然后转染BHK－21细胞进行瞬时表达，用 Western－blot分析转染细胞裂解物，发现在未还原条件下重组MIC3是100 k D二聚体，在还原条件下是42 k D单体，与弓形虫中分离提纯的天然MIC3二聚体（90 k D）和单体（38 k D）存在差异。认为切割MIC3前体的蛋白水解酶是弓形虫所特有，哺乳动物细胞中缺乏该酶，不能对MIC3进行前体肽的降解，但可折叠成二聚体（100 k D）。虽然哺乳动物细胞表达的重组MIC3二聚体或单体不能有效地与宿主细胞表面结合，但仍然保留其与相应抗体发生特异性结合的性质。2条38 k D多肽还可通过蛋白质间的相互作用连接形成成熟的90 k D二聚体。Ismael等［4］的研究也得出了同样的结论。

江涛等［7］采用分子生物信息学软件对全长的MIC3的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。发现该蛋白结构中含有较多的α－螺旋区段，主要集中分布于蛋白质的两端；非常丰富的β－转角，比较集中地分布在蛋白质的中间区域；较多的无规则卷曲，其结构比较松散、突出，易于形变，多位于蛋白质分子表面。MIC3的B细胞抗原表位的优势区域位于N端第83～94、136～141和240～243区段内或其附近。

2 MIC3的功能

Cérède［3］通过细胞转染试验观察到，Vero细胞能与天然的MIC3强烈结合，但不能与重组MIC3（r MIC3）反应，认为裂解 MIC3前肽的蛋白酶是弓形虫特有，前肽序列的存在阻碍了这种结合（粘附），但并不妨碍二聚体的形成。信号肽能引导MIC3的正确分泌、转运与定位，而切除信号肽的重组MIC3也能结合到宿主细胞的表面，共聚焦技术分析发现MIC3能通过直接与宿主细胞表面受体结合而发挥作用。还发现EGF样结构域不参与MIC3对宿主细胞受体的识别，或者单独的EGF样结构域不能提高MIC3对宿主细胞的粘附力，但有助于正确呈现粘附模体的结构，可能在其构象形成中发挥作用，并且EGF样结构域还参与MIC3和其陪护伴侣MIC8形成MIC3－MIC8复合体。CBL序列是弓形虫的粘附模体，二聚体的形成是CBL模体发挥作用的重要因素。CBL结构域含有的半胱氨酸和高度保守的芳香族残基，可以保证蛋白结构的正确折叠和与宿主细胞膜上N－乙酰葡萄糖胺的结合。

Cérède等［8］进一步研究发现，将 MIC3的 CBL结构域上的126位色氨酸替换成甘氨酸、128位苯丙氨酸替换成甘氨酸的突变株对小鼠的侵染能力明显下降，攻虫感染40 d后的小鼠存活率分别为83.3%和95% 。表明MIC3上的CBL结构域与弓形虫侵染细胞能力有密切关系。

3 MIC3的应用

3.1 在疫苗上的应用 Ismael等［4］用编码不成熟MIC3的质粒p MIC3i肌肉免疫接种CBA/J小鼠，结果全部小鼠血清中抗p MIC3i特异性抗体IgG滴度很 高，出 现 大 量 的 IFN－γ 及 IL－2、IgG2a 和IgG2b，说明p MIC3i能激发强烈的体液免疫和细胞免疫；用编码粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子基因的质粒p GM－CSF与质粒p MICi3联合免疫接种小鼠后，能产生更显著的体液免疫应答和细胞免疫应答；小鼠经3次免疫后，口服弓形虫76 K株包囊，1月后经检测其大脑内的包囊数量明显少于对照组小鼠，且联合免疫接种对小鼠能起到更好的保护作用。

Ismael等［9］将弓形虫RH株的 MIC1和 MIC3基因敲除，构建 MIC1－3KO突变株，腹腔注射小鼠（20个速殖子/只），能激发强烈的体液免疫和Th1型细胞免疫，血清中IFN－γ、IL－2、IL－10的滴度明显增加；71 d后以虫株76 K卵囊45个口服感染免疫小鼠，发现小鼠大脑组织中弓形虫包囊数比对照组减少96%以上。Mévélec［10］以105个 MIC1－3KO 株速殖子皮下接种3组母羊，只出现轻度的发热反应。免疫母羊1月后配种，在妊娠中期口服弓形虫PRV株卵囊（1、2组分别400个，3组100个），同时设未免疫对照组，结果发现试验组母羊只出现轻微体温升高，所产羔羊未见弓形虫感染的临床症状，3组羔羊的存活率分别为62%、91%和64%。说明MIC1－3KO虫株与S48虫株有相同的免疫效果，认为MIC1－3KO虫株是具有开发应用潜力的疫苗。

江涛等［11］构建了弓形虫RH株 MIC3基因的原核表达质粒载体p GEX－KG－MIC3，其表达产物r MIC3主要以包涵体形式存在，Western－blot试验可被兔抗弓形虫免疫血清识别，显示有良好的反应原性。以纯化、复性的r MIC3混合免疫佐剂皮下注射Balb/c小鼠，6 w血清特异抗体滴度和攻虫后小鼠的平均存活时间与对照组比较有明显提高［12］。构建MIC3基因的真核表达质粒pc MIC3转染IBRS－2细胞后，其表达的蛋白质具有良好的免疫活性［13］；再将质粒pc MIC3以肌肉注射的方式间隔2 w 3次免疫Balb/c小鼠，同时设空载体pc DNA3.1和PBS对照。在首免后第8 w分别以MTT比色法和CTL法测定小鼠脾淋巴细胞的增殖应答和细胞毒性T细胞（CTL）毒活性。与对照组相比，免疫小鼠脾淋巴细胞和CTL毒活性均极显著增强（P＜0.01）。表明pc MIC3质粒免疫的小鼠能诱导强烈的细胞免疫反应和体液免疫反应。在免疫8 w后以弓形虫RH强毒株攻击，第45 d的平均生存率达78%，而对照组在7.5～9 d时全部死亡［14］。

张燕丽等［15］构建了弓形虫GJS株MIC3基因的真核表达质粒pcDNA－MIC3，转染BHK－21细胞后，表达产物可被羊抗弓形虫超免血清识别，具有良好的抗原性；pcDNA－MIC3质粒肌肉注射Balb/c小鼠，血清中出现高滴度的特异抗体，对GJS虫株的攻击产生较强抵抗力。

Fang等［16－17］构 建 了 弓 形虫 RH 株 MIC3 基 因的自杀性重组质粒载体pSCA/MIC3和重组杆状病毒疫苗 Ac－V－MIC3，能高效转染（导）哺乳动物BHK－21细胞和PK－15细胞，并进行有效表达；分别免疫Balb/c小鼠，均能产生强烈的体液免疫和细胞免疫，并有效抵抗致死性虫株的攻击。

3.2 在 诊 断 上 的 应 用 江 涛 等［18－19］以 纯 化 的r MIC3作为抗原建立了乳胶凝集试验（LAT）和ELISA等2种弓形虫病诊断方法，检测人工试验感染弓形虫猪，发现分别在感染的4～57 d、14～57 d可查到血清中特异性抗体，且分别在8～45 d、18～45 d的检测阳性率达100%（8/8），2种方法检测衣原体、胸膜肺炎放线杆菌、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、旋毛虫、圆环病毒、副猪嗜血杆菌、伪狂犬病病毒及附红细胞体阳性血清均为阴性，具有特异性高、反应灵敏、操作简便等特点，优于以虫体天然成分为抗原建立的IHA。张东林等［20－21］以r MIC3为抗原建立SPA－ELISA和AG－ELISA，检测猪、山羊等动物弓形虫感染，操作简便、快速，效果良好。张源源等［22］以原核表达的r Tg MIC3为抗原建立ELISA，用于检测22只实验感染弓形虫ME49株7 d后的小鼠血清抗体，阳性率为100%，而12只实验感染牛新孢子虫的小鼠血清均为阴性，表明以r Tg MIC3为包被抗原的ELISA检测弓形虫抗体具有较高的敏感性和特异性。

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