皮肤微透析技术在药动学及药效学研究中的应用进展Δ

李静雅，朱 丹，刘建勋，林 力#（.中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京市 0008；.中国中医科学院西苑医院，北京市 0009）

微透析（Microdialysis，MD）是20世纪60年代在对动物脑内的游离氨基酸和神经递质的研究中提出的概念[1]，20世纪70年代发明MD探针后，MD技术广泛应用于神经药理学，并逐渐扩展到血液及多种器官和组织的研究中。20世纪90年代初期，MD技术开始应用于皮肤药理学的研究，最初是由Anderson等[2]用于人真皮内乙醇含量测定，此后，皮肤微透析（Dermal microdialysis，DMD）广泛应用于皮肤病生理学、皮肤药动/药效学和皮肤毒理学研究。本文现就近年DMD技术在药动学和药效学研究中的应用进展进行简要综述。

1 概述

DMD技术是通过平行埋植于真皮层或皮下组织层的线性探针（Linear probe）以及探针中灌流的生理性溶液，使皮下内源或外源性物质以一定的比例顺浓度梯度透过探针的半透膜进入透析液中。在一定的流速下，按一定时间间隔对透析液进行采集并分析，从而可通过透析液的浓度估算真皮层或皮下组织中特定成分的浓度变化，不需要损失体液或破坏组织，可以进行活体皮肤的实时检测，因此MD采样法适合于药物经时变化的检测。

皮肤是人体最大的器官，具有特殊的屏障功能和生理特点，经皮给药系统（TDS）能够改善患者用药的顺应性并发挥局部起效优势，因此研究药物在皮肤的渗透、吸收、代谢以及起效机制对于经皮药物的设计和评价有重要意义。但是传统的皮肤药理学研究方法如胶带剥离法、活组织检查法等需要破坏皮肤组织，不能真实反映正常皮肤的通透特性，对皮下组织的游离药物和结合性药物也无选择性；而离体皮肤渗透实验不能代替在体皮肤研究。相较之下，DMD技术能进行在体原位检测，对皮肤破坏小；可选择性地采集非结合性药物；可同时在多位点进行采样，因此DMD成为少数适合于研究皮肤药动学进而评价经皮制剂生物利用度和生物等效性的研究方法之一[3]。与此同时，DMD具有能同时采集外源性和内源性化合物的特点，因此近年来，该技术在皮肤病生理机制及药效机制研究领域发挥着重要的作用，被广泛应用于皮肤炎症、皮下微循环机制以及局部抗炎药物药效研究中。

2 皮肤药动学研究

2.1 透皮吸收的研究

经皮给药发挥药效的关键问题之一是药物的透皮吸收速率和程度，也是评价外用制剂的重要方面。与其他的皮肤药动学研究方法相比，DMD技术能够更灵敏地反映出药物透皮吸收的实时特性，并且能够比较药物在不同部位的渗透和吸收差异，因此在药物的透皮特征的研究中应用广泛[4]。近年来，随着各种透皮促进技术和方法，如离子导入技术、微针技术的发展，利用DMD考察这些技术透皮促进效率的报道不断增多[5～8]。近年研究表明，阿米替林具有局部止痛的作用[9]，Patel等[5]给兔去毛皮肤给予阿米替林，分别以100、200、300 μA·cm－2的强度进行离子导入处理60 min，以DMD联合高效液相色谱（HPLC）法测定给药部位皮下药物浓度，并测定其血药浓度，3个强度下的离子导入后，皮下药-时曲线下面积（AUC）分别为（19±7）、（119±56）、（615±302）mg·min·L－1，而血药浓度始终低于检测限，表明离子导入技术能促进阿米替林的局部皮肤渗透，且入血量极低，从而降低药物进入循环系统对中枢神经产生的作用。Shukla等[6]研究阿昔洛韦不同辅料配方的半固体制剂在兔皮肤的吸收差异，配合离子导入法分别给予中性软膏和pH11的碱性凝胶剂，结果表明pH11的凝胶剂在真皮层的吸收量显著高于中性半固体制剂。

DMD技术的优势之一就是能够进行在体采样，并保持皮肤结构的完整性，因此与传统皮肤药动学采样方法相比，准确性更高。DMD还可多位点的植入，从而可以对同一种制剂在正常皮肤与患病皮肤的渗透吸收特性进行比较。Ortiz等[10]分别以DMD和胶带剥离采样法测定患刺激性皮炎处皮肤对甲硝唑的渗透性，结果表明DMD法取样患病处皮下药物浓度为正常皮肤的3倍，而胶带剥离取得的样品测得结果相反；之后，又以此2种方法比较了遗传过敏性皮炎与正常皮肤对甲硝唑乳膏剂的吸收[11]，DMD取样法显示患病皮肤的药物浓度为正常皮肤的2～4倍，而胶带剥离样品浓度结果差异无统计学意义。由此认为取样方法的选择直接影响药物透皮吸收的测定结果，而DMD法能够用于此类研究中。

2.2 生物利用度（Bioavailability，BA）和生物等效性（Bioequivalence，BE）评价

BA和BE反映了药剂的有效成分释放进入血液循环，进而到达起效部位的速率和程度，是以药动学参数评价制剂质量或新剂型可行性的重要指标。理想的经皮给药局部起效制剂，要求能够在给药部位迅速地吸收和处置，但进入血液循环的药量不能过高。目前，能够用于皮肤给药制剂生物等效性评价的研究方法非常有限，而DMD技术微创、实时的特点使其成为BA/BE研究的理想工具。Tettey-Amlalo等[12]对18名受试者给予酮洛芬凝胶剂并进行DMD取样，分析DMD技术用于BE评价的可行性，认为DMD取样难以得到准确的峰浓度（cmax）数据，可以药-时曲线下面积（AUC）作为评价指标。Mathy等[13]以皮下和血液双位点微透析取样的方法，研究并比较静脉注射剂和皮肤凝胶2种剂型的氟康唑在大鼠皮肤和血浆中的药动学参数。结果表明，按10 mg·kg－1静脉注射给药后，氟康唑迅速渗透进入皮肤，血液与真皮游离药物浓度-时间曲线相近，AUC分别为（5 985.1±192.3）、（5 943.9±200.0）µg·min·mL－1。而皮肤局部给予氟康唑凝胶0.5 g后，AUC0～674h为（271.7±28.4）µg·min·mL－1，cmax达到（637.1±177.8）ng·mL－1，超过最低抑菌浓度（MIC 0.25～0.5 µg·mL－1）。Brunner等[14]对一种新型双氯芬酸喷雾凝胶经皮给药后的血药浓度、皮下组织和骨骼肌分布与双氢芬酸钠口服制剂进行比较，以DMD测定皮下脂肪的药物浓度，结果表明凝胶剂的相对生物利用度皮下和骨骼肌分别为口服用药的344%和209%，而血药浓度仅为口服给药的50%，认为新剂型具有良好的局部渗透性和较低的系统分布，可以作为口服制剂的替代剂型用于软组织炎症的治疗。

重现性较差是DMD目前还没有很好解决的一个问题，这是影响BE评价结果准确性的主要因素[3]。可能造成DMD样品差异性的原因主要有2方面：受试个体的皮肤通透性差异以及探针埋入操作的稳定性。探针的埋入深度不同会影响样品浓度，但通过反复练习并配合超声扫描检测则可以提高埋入深度的稳定性[15]。Tettery-Amlalo的试验验证了熟练的操作人员在人体前臂埋入探针所产生的细小深度差别与AUC的差异无相关性。而个体差异性的问题可以通过增加样本量的方法加以校正。Garcia等[16]在研究甲硝唑的BE中，选取14名受试者进行DMD取样，发现DMD样品的差异性影响试验结果。Benfeldt等[17]则认为BE研究的样本量至少应在18人以上，并且建议配合无创性的检测手段对皮肤温度、表皮水分流失量和皮下血液循环进行评估，以分析皮肤功能和通透性的个体差异。

2.3 系统给药的皮肤分布考察

DMD技术应用于系统给药的药动学研究具有以下意义：以皮肤或局部软组织为靶器官的药物，可以对其皮肤药物浓度进行评价及对药物的皮肤副作用进行研究。Traunmuller等[18]比较了患糖尿病并发足感染患者静脉注射利奈唑胺600 mg后，健康皮肤、发炎皮下组织和骨松质中的药动学参数，cmax分别为（15.5±2.5）、（15.8±2.8）、（15.1±4.1）mg·L－1，认为此浓度下可有效抑制外周软组织感染。Traunmuller等[19]所做的另一个关于克拉霉素在皮下脂肪组织的药动学特性研究中，选择6名健康受试者，以每日2次、每次500 mg的剂量口服克拉霉素，达到稳态血药浓度之后测定皮下组织中的药物浓度，结果表明皮下药物浓度AUC0～24h为（0.84±0.19）mg·h·L－1，与血液中的AUC的比为（0.39±0.04），认为此剂量不能达到治疗皮肤和软组织感染的有效浓度。

DMD采样可以反映皮下药物浓度经时变化，因此近年来有研究验证并建立以DMD的浓度-时间特征反映体内血药浓度变化，或反之根据血药浓度预测皮下浓度。Engleman等[20]提出并验证以皮肤乙醇浓度-时间变化表征饮酒者体内酒精含量的方法：选择成年Wistar大鼠和嗜酒大鼠作为研究对象。首先，给大鼠腹腔注射剂量依次为0.5、1.0、2.0 g·kg－1的乙醇，结果测得其皮下DMD样品浓度在15 min达到最大值，分别为70、123、203 mg；然后，分别以灌胃和腹腔注射的方式，以1.0 g·kg－1的剂量给予大鼠乙醇，比较血液乙醇浓度-时间曲线与皮下DMD样品浓度-时间曲线，认为两者具有相关性。Shukla等[21]分别给兔静脉注射阿莫西林和头孢呋辛，DMD取样测定皮下药物浓度，并同时测定血药浓度，计算血液-皮下药物分布常数Kin（血药浓度/皮下浓度）和Kout（皮下浓度/血药浓度），通过此分布常数建立以血药浓度预测皮下药物浓度的方法，并与DMD实际测得的结果进行比较，结果表明根据该方法所预测的药物浓度与实际浓度接近。

3 药效学及其机制研究

选择不同分子截留值（Cut-off）的探针，可以选择性地提取不同分子量大小的成分，较小的截留值可用于测定药物浓度，而选择大截留值的探针可以采集内源性物质，因此DMD法可以用于检测皮下某些生物标记物，从而对皮肤病生理及药效学机制进行研究。目前DMD主要用于皮肤炎症机制和皮肤局部血液循环调控机制的研究。近年来有报道对如肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1、IL-6、IL-8、前列腺素（PG）、异前列腺素F（2）-IsoPs、组胺等炎症因子[22～26]进行MD取样，从而可以对外用局部抗炎药的药效学进行评价。Shinkai等[27]用巴豆油建立大鼠皮肤炎症模型，皮下埋入MD探针后，给予联苯乙酸贴剂，测定MD样品的药物浓度的同时，对其中PG-E2水平进行测定，结果表明，巴豆油能显著升高皮下PG-E2水平，而在给予0.5%或3.5%联苯乙酸贴剂2～5 h后PG-E2水平显著下降。在Shinkai等[28]的另一项研究中，证明酮洛芬经皮给药能够显著降低皮肤和关节液的PG-E2含量。Brazis等[29]研究环孢菌素A对比格犬皮肤组胺和PG-D2水平的影响，结果表明组胺水平在治疗15～30 d之后显著下降，但PG-D2水平无显著变化，说明环孢素A是通过抑制组胺释放发挥抗炎作用的。皮肤病生理机制研究也是DMD的主要应用领域。配合激光多普勒血流测定，同时以DMD作为采样和给药的方式，可以对皮肤局部血流的机制通路进行验证。比如Hubing等[30]在人前臂埋入MD探针后，分别向其中灌流含有PG抑制剂酮咯酸、一氧化氮（NO）合成酶抑制剂L-精氨酸甲酯和空白生理盐水溶液，从而验证皮肤潮红部位的血管扩张调节与PG以及NO的关系。

4 结语

DMD技术不断发展并被广泛应用，促进了皮肤药理学的深入研究以及经皮给药系统的发展，但此技术仍有不足之处。首先，是重现性较差的问题，埋入深度和持续时间以及皮肤的差异会影响重现性，这些因素与探针提取率之间的关系是DMD方法学研究中的重点之一。目前在深度与回收率差异的相关性问题上还存在争议，需要进一步研究证明。其次，DMD对亲脂性药物和高蛋白结合率的药物不敏感，虽有文献报道[31]向灌流液中加入白蛋白可对结合型药物进行提取，但样品中引入的蛋白质需要预处理，因此亲脂性药物的提取方法需要优化。再次，埋入探针会诱发局部炎症和排异反应，使得取样持续时间受到限制，对皮肤炎症的研究也会产生一定影响。因而，如何改进DMD试验方法以降低炎症对试验结果的影响也是今后的研究重点。

在中医药领域，DMD的应用还不够广泛，主要是中药经皮给药新型制剂的吸收分布研究，如青藤碱的皮肤药物含量和药动学参数测定[32]、葛根素皮下含量的测定[33]等。近年来脂质体制备技术日趋发展，多用于局部经皮给药制剂，具有增加难溶性药物溶出、增强皮肤靶向性、增加药物在皮肤局部蓄积以及持续释放药物的特点，是经皮给药制剂的理想载体[34]。利用脂质体技术开发中药新制剂目前已有报道，凌家俊等[35]利用MD技术研究比较青藤碱脂质体贴剂与普通贴剂的药动学特性，认为脂质体贴剂具有更高的生物利用度且具有贮库效应。中药虽对多种病症疗效确切，但中药本身成分复杂，很难对其起效机制和代谢过程进行研究。近年来利用MD技术进行药动/药效学研究的方法日趋成熟，可以将这一思路引入中医药研究。DMD创伤小、患者顺应性好，近年国外有大量关于DMD临床试验的报道，可以将DMD应用于中药临床研究，从而为阐明药效学机制以及中药新剂型的质量评价提供依据。

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