产志贺毒素大肠杆菌流行病学和stx基因研究进展

周 勇，陈守义

感染产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin－producing Escherichia coli，STEC）能引起人严重的疾病，包括：出血性肠炎（Hemorrhagic coltis，HC）、血栓性血小板紫癜（TTP）和溶血性尿毒综合症（Hemolytic－uremic syndrome，HUS）甚至死亡［1－4］。

目前发现可引起人类感染的STEC有472种血清型，但经常引起人患病的血清型不到10种。Karmail等［5］推荐根据血清分型和致病力强弱将STEC从A到E分成5个型别。A型为致病力最强的血清型；包括O157∶H7和O157∶NM。B型为能引起严重疾病和暴发流行但感染发生率较A型低的血清型；例如：O26∶H11，O103∶H2，O111：NM，O121∶H19和O145∶NM。C型与散发的HUS有关，很少引起暴发流行；包括：O91∶H21和O113∶H21。D型通常只引起人腹泻的散发病例，E型包括其它与人疾病无关的STEC血清型。Scheutz等［6］建议以毒力基因图谱将STEC分为3组。第1组包括能引起HUS和或能引起暴发流行的STEC；第2组由可引起人腹泻但不发生HUS的STEC组成；第3组为引起动物疾病的STEC。

1 STEC流行病学概况

STEC感染是动物源性疾病，反刍动物是STEC的自然宿主，其中牛是最重要的宿主［7－8］（在澳大利亚，绵羊是重要宿主［9］）。研究发现除了牛，羊、猪、猫、鹿、马、狗、家禽和野禽等都可分离到STEC［9－12］。目前发现有超过435种血清型 STEC分离自牛，牛由于缺少志贺毒素（Shiga toxin，Stx）受体所以不致病［7，13－15］。牛 粪便中 STEC 分 离率 与季节有关，夏季分离率较高，相应夏季人类感染STEC患病率也随之升高［16－17］。此外，未断奶的小牛STEC分离率较低，断奶后到成年之间的时段分离率最高，成年后的分离率下降至中等［18－19］。

人感染STEC通常经过进食生的或未熟的肉类、生牛奶或者生食被污染的蔬菜水果而发病，也有在屠宰牲畜和生肉加工时被感染［20］。有研究表明低于100CFU的STEC就能引起人致病，因此直接接触患者也可引起继发感染［21］。

2007－2009年，欧盟各成员国每年检测超过一万份牛肉样本，STEC的检出率为0．3%～2．3%，其中O157∶H7的检出率为0．1%～0．7%。相比较而言，在蔬菜和水果中的检出率则低很多，分别是STEC 0．19%和 O157∶H7 0．14%［22］。在英国、加拿大、新西兰和泰国等STEC检出率为9%～12%［23－26］，美国华盛顿州的3份研究中，STEC 的检出率分别是1%、17%、23%［27－29］。在阿 根廷，Parama等［30］从50份碎牛肉中检出15份STEC阳性标本，在印度，Khan等从111份碎牛肉中查出近50%样本为 STEC PCR 阳性［31］。

不同国家甚至一国不同地区的检出率都存在一定差异，有的可能与流行趋势有关，但也存在实验技术方面的原因，比如采样方法的不同、样本数量的大小和样本的选择以及检测技术的不同（到现在还没有统一的STEC特别是非O157STEC的检测标准），此外很多研究主要关注O157∶H7的检测。这些差异造成各实验室数据很难进行比较研究。

由于O157∶H7是STEC中致病力最强、流行趋势最广、发病率最高的血清型，因此在STEC流行病学研究中，经常将O157STEC和非O157 STEC分成2类来进行分析。自1982年美国首次报道O157∶H7暴发流行以来，近30年不断有O157∶H7在全球暴发流行和散发病例的报道［32］。1993年美国发生了一次涉及到4个州700余名儿童的O157∶H7暴发，其中41例发生HUS，4例死亡［33］。1996年5－8月在日本发生的O157∶H7暴发流行，患者9 000余名，死亡9人［34－35］。1999－2000年我国苏皖等地发生的O157∶H7大规模暴发流行，患者约2万人，发生急性肾功能衰竭者195人，死亡人数177人［36］。而近十年非O157STEC血清型也不断有感染流行的报道。此次始于德国的O104∶H4暴发流行，涉及13个国家，感染4 125人，发生HUS 892例，死亡49人（2011年7月1日数据），是迄今为止非O157STEC感染暴发流行最严重的一次［37］。

在北美 STEC O26、O45、O103、O111 以及O121是最常引起感染的非O157血清型；在欧洲则以 O26、O103、O91、O145为主［12］。欧盟 CDC汇总各欧盟成员国上报的2008－2009年STEC感染病例，其中O157感染占51%～53%，O26占5．3%～5．4%，O103 2．3%～2．8%，O91 1．3% ～1．6%，O145 1．3%～1．6%，未分型及不能分型的占25．9%～28．2%［22］。

STEC感染导致HUS的病例中接近75%发生在儿童，其中年龄低于10岁的儿童最易感。15%感染STEC后有腹泻症状的儿童会发展成HUS，50%的HUS患者最终导致肾衰需要血液透析治疗，而HUS致死率接近5%［38－40］。2009年 Hedican在美国明尼苏达州对O157和非O157STEC感染的特征进行比较，发现O157感染导致的出血性腹泻（78%比54%）、HUS（7%比0%）和入院率（34%比8%）都比非O157高。同时发现只有当O157菌株携带stx2基因时发生出血性腹泻和入院率比非O157高。此外，在检测到的非O157中，74%的血清型属于O26、O103、O111、O145、O45等5个血清型［41］。Gould在另一项研究中也比较了2者的HUS发生率（O157 6．3%比非 O157 1．7%）、入院率（O157 42% 比 非 O157 12%）、死 亡 率 （O157 0．6%比非O157 0．1%）。而在这项研究中，82%的非O157菌株属于 O26、O111、O103、O121、O145、O45等6个血清型［42］。

2005－2009年，欧盟成员国共有16 263份人感染STEC的病例报告。其中在2009年有3 573份确认病例，发病率是每十万人0．75。发病率最高的是爱尔兰，09年确认病例237份，发病率为每十万人5．33；其次是丹麦，确认病例160份，发病率每十万人2．9。在2007－2009年，9 637份确认病例中548份发生HUS（占6%），其中71%由O157引起，15%由O26引起。2006－2009年，欧盟成员国每年因为STEC感染而致死的人数是2～6人［22］。

2 stx基因及其分型概述

志贺毒素（Shiga toxin，Stx）由位于STEC染色体上的前噬菌体携带的stx基因编码。Stx是STEC的主要毒力因子，包括2个没有抗原交叉反应的 Stx1（VT1）和 Stx2（VT2）。1977年，Konowalchuk等［43］发现某些大肠杆菌可产生一种对非洲绿猴肾细胞有致死作用的细胞毒素，将其命名为Vero细胞毒素（Vero cytotoxin，VT）。VT属于Stx家族，包括Ⅰ型痢疾志贺菌表达的Stx以及VT1、VT2。VT1与Ⅰ型痢疾志贺菌表达的Stx的序列同源性达99%。由于VT与Stx的高度同源性，一开始它们也被命名为志贺样毒素Ⅰ型（Shigalike toxinⅠ，SLTⅠ）和志贺样毒素Ⅱ型（Shiga－like toxinⅡ，SLTⅡ）。1994年，O’Brien推荐SLT和VT都可以用来命名大肠杆菌产生的志贺毒素。2年后，Calderwood建议取消Shiga－like toxin名称中的“like”，直接使用Stx来命名志贺毒素同时VT的命称保留并可与Stx互换。此后，这一建议被广泛采用［44］。

目前研究发现Stx1和Stx2都有变种，Stx1有2个变种Stx1c和Stx1d［45］，Stx2至少有12种变种（Stx2c、Stx2－O113、Stx2－O48、Stx2vh－a、Stx2vh－b、Stx2d－OX3、Stx2－OX3b、Stx2d－O111、Stx2d－O118、Stx2e、Stx2－NV206和Stx2g），并不断有新的变种被发现［46－48］。Bertin［46］用 PCR扩增编码Stx2B亚单位的基因片段，然后用HaeⅢ、RsaⅠ、NciⅠ分别酶切扩增的基因片段，通过酶切产生的片段大小来对stx2进行分型。现在这种PCR－RFLP方法是常用的stx分型方法。Beutin［45］则用BstEⅡ、HaeⅡ、PflMⅠ酶切编码Stx1B亚单位的PCR扩增产物将Stx1的编码基因分成stx1、stx1c、stx1d等3种亚型。

STEC由于血清型众多，单从血清分型无法得到菌株携带毒力基因的情况也就无法判断菌株致病力的强弱，因此利用分子生物学方法对STEC菌株的毒力基因进行分型是常用的STEC分型方法。除了上述的 PCR－RFLP方法，Persson［48］等使用2对引物对StxAB2操纵子的部分特异性片段（491 bp）进行扩增，然后测序，再将序列与GenBank上的序列进行对比，结果发现该方法可以对stx2基因进行分型。测序方法可以避免PCR－RFLP分型的某些缺陷，比如序列中存在单核苷酸的改变、酶切片段太小以至电泳无法分辨或者存在相同大小的片段等。在此研究中，Persson采用Schetuz的建议对STEC菌株采用O血清型加菌株名称加stx2基因型的模式进行分型。利用这一原则，Persson等将255株从患者中分离到的STEC分成12个亚型。其中，Stx2－O157－EDL933、 Stx2－O48－94C、 Stx2c－O157－FLY16、Stx2c－O157－C394－03、Stx2－O157－EDL933＋Stx2c－O157－FLY16、Stx2－O48－94C ＋ Stx2c－O157－FLY16分离自HUS患者。此外，PFGE在相同血清型菌株之间的分型可以用于流行病学调查和感染溯源。

3 stx基因及其亚型与临床症状关系的研究

每一STEC菌株只会携带一种stx1基因，但可以携带2种stx2基因，某些菌株可同时携带一种stx1基因和1种或2种stx2基因。目前的研究热点在于不同的stx基因型与人类疾病的关系。stx1和stx2d主要多见于引起腹泻症状但很少导致HUS的菌株；stx2和stx2c常见于引起HUS的菌株；携带stx2e的菌株最早分离自患水肿病的猪［49］；stx1c和stx2d－O118分离自绵羊［50－51］；stx2f 分离自鸽子［52］。Feriedrich［53］等对分离自HUS患者的268株STEC和有腹泻但无HUS患者的262株STEC以及无症状携带者的96株STEC进行stx基因型的分析，发现stx1主要分离自腹泻患者和无症状携带者，stx2主要分离自HUS患者，此外stx1＋stx2和stx2＋stx2c也可分离自HUS患者。这项研究和世界各地的研究基本一致，即单独携带stx2的菌株最易引起HUS，然后是stx2＋stx2c，单独携带stx2c的菌株则较少引起HUS，单独携带stx1的菌株罕见引起HUS［48，54］。很多研究发现大部分 O157菌株只携带stx2基因，因此O157是引起HUS的主要血清型。此次德国暴发流行的O104∶H4也是单独携带stx2基因［55］。Eklund等［54］通过细胞毒性实验和反相乳胶凝集（RPLA）测定STEC菌株产志贺毒素的能力和滴度，发现携带stx2基因的菌株产生志贺毒素的滴度比携带stx1和stx2基因亚型的菌株高。

4 其它毒力因子与疾病关系

eae基因编码紧密黏附素（Intimin），介导细菌与宿主小肠上皮粘膜的黏附，能引起黏附和抹平损伤（Attaching－effacing lesion，A／E lesion）。很多研究认为STEC引起人类HUS的原因很复杂，仅仅Stx的参与还不够，还需要Intimin的协同作用，但目前这一机制仍不清楚。Intimin N末端较保守，C末端280个氨基酸（IntC280）是与其受体结合的区域，在不同血清型菌株中差异较大。目前根据编码Intimin C末端的eae基因序列的差异可将其分为21个亚型（α1、α2、β1、ξR／β2B、δ／β2B、κ、γ1、γ2、θ、ε1、νR／ε2、ζ、η1、η2、τ1、μR／τ2、λ、μB、νB、ξB、ο）［56］。

某些STEC菌株可表达一种被称为溶血素（Haemolysin，Hly）的蛋白，是孔道形成蛋白（Poreforming proteins）家族成员，可在靶细胞膜上形成孔道而杀死靶细胞，与出血性肠炎密切相关。Hly由菌株携带的质粒上的ehxA基因编码［57］。

STEC携带的数种毒力基因及其亚型在引起宿主疾病发展中的协同作用仍需要进一步研究去阐明。但流行病学调查发现某些血清型及某种毒力基因亚型常引起人感染发病。Mora等［56］1995－2003年在西班牙卢戈从785份牛肉标本中检出96株STEC，其中29%携带stx1、51%携带stx2、20%（stx1＋stx2）、26%eae、45%ehxA。他们把血清分型和毒力基因分型结合起来分析，所有分离菌中O157∶H7 stx1stx2eae－γ1ehxA 有5株，O8∶H21 stx2和ONT∶H21 stx1各 4 株，O26∶H11 stx1eae－β1 ehxA和O64∶H5 stx1各3株，而这几种血清毒力分型的菌株也频繁地从当地的腹泻患者中分离检出。Eklund［55］等分析173株从患者中分离的STEC菌株，根据血清型和毒力基因型将173株分成10个组。其中毒力最强一组的毒力图谱是O157∶H7∶stx2stx2c：eae：ehxA，共有55株。这55株中有9株分离自HUS或TTP患者，30株分离自出血型腹泻患者，8株分离自非出血型腹泻患者，7株分离自非症状携带者，1株无相关数据。第2组属于O145∶H28／H ：stx2：eae：ehxA，有7株，其中3株分离自HUS或TTP患者，3株分离自非出血型腹泻患者，1株分离自非症状携带者。这些研究说明除stx基因外，eae和ehxA可能都参与了疾病的发展。目前发现eae和ehxA阳性的菌株大部分属于肠出血型大肠杆菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC），其中 O157、O26、O111、O145等是重要血清群。近期在德国暴发流行的O104∶H4属于肠聚集型大肠杆菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAggEC），研究其毒力基因发现其仅携带stx2，stx1、eae、ehxA 均阴性，O104∶H4的stx2与O157∶H7ATCC EDL933的stx2核酸序列仅有一个碱基的差异，而氨基酸序列100%相似。O104∶H4携带有肠聚集型大肠杆菌的标志性毒力基因aggR、aatA、aggA等基因，但缺少eae使其粘附机制与典型的STEC有所不同，这也可以解释为什么O104∶H4主要引起成年人患HUS，而不像典型STEC那样主要引起儿童患HUS。不产志贺毒素的O104∶H4曾在多个国家引起婴幼儿持续性腹泻和AIDS患者腹泻，也有产志贺毒素的O104∶H4的散发病例报道［54］。但不产志贺毒素的O104∶H4通过什么途径获得stx2基因以及O104∶H4携带的肠聚集型大肠杆菌的标志性毒力基因与stx2基因如何在疾病发展中协同作用仍需要进一步研究去证实。

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