白念珠菌对唑类药物的耐药与对策＊

王志远，张 宏，张革化

白念珠菌对唑类药物的耐药与对策＊

王志远1，张 宏2，张革化1

随着广谱抗生素、化疗药的广泛使用，器官移植手术和患有基础疾病的人群数量的激增，白念珠菌已成为人类真菌感染的最常见的病原菌。一线抗真菌药氟康唑等唑类药物的长期应用，白念珠菌的耐药株已广泛出现，引起临床医生的广泛关注。本文主要介绍白念珠菌对唑类药物的耐药机制以及如何逆转耐药相关对策的研究工作的新进展。

1 白念珠菌感染现状

白念珠菌（Candida albicans）为念珠菌属中的主要致病菌，是一种常见的条件致病性的真菌，可寄居于正常人群中的胃肠道、阴道和口腔粘膜。当机体免疫功能低下时，可导致口腔念珠菌病、阴道炎、真菌性鼻窦炎、外耳道炎等，甚至可引发危及生命的系统性念珠菌感染。在美国，8%～10%的医院血流感染（nosocomial bloodstream infection，BSI）的主要致病菌为念珠菌属。国外多中心统计了1997－2007年的256 882例医院真菌感染中，白念珠菌占65．3%［1］。土耳其某三级医院回顾研究了1996－2007年12年间743例念珠菌菌血症患者，发现白念珠菌感染者占45%［2］。最近2项流行病学调查显示，白念珠菌血流感染患者病死率分别为44%和43．6%［3－4］。由此可见，白念珠菌感染率和病死率高，已成为人类的健康杀手。

2 白念珠菌对唑类药物的耐药现状

氟康唑、伊曲康唑等三唑类药物因其安全和有效性，成为临床上治疗念珠菌病最常用的一线抗真菌药物。但是，此类药物的长期使用导致耐药株广泛出现。41个国家多中心研究发现，白念珠菌对氟康唑的耐药株已从2000年的0．9%上升到了2007年的1．4%［1］。Goldman等（2000）对免疫缺陷病人进行了一项前瞻性研究，发现伊曲康唑治疗组与安慰剂组分离培养的白念珠菌对氟康唑的耐药率分别为22%和4%。Wroblewska等［5］从临床上分离了851株白念珠菌，其中37．2%对氟康唑耐药、47．6%对伊曲康唑耐药。Magaldi等（2001）从艾滋病患者身上分离培养出白念珠菌，发现其对氟康唑原发耐药率为10%，而经抗真菌治疗后耐药率上升为45%。白念珠菌对唑类药物的耐药已经成为临床棘手的问题。目前，有关白念珠菌的耐药机制的研究主要包括药物外排泵的改变、靶酶的变化、生物膜的形成、细胞壁成分的变化等方面。

2．1 药物外排泵的改变

2．1．1 药物外排泵 Sanglard（1995）和 Albertson（1996）的研究发现白念珠菌对氟康唑的耐药性与能量依赖的外排泵相关。研究证实2个外排泵系统与白念珠菌氟康唑耐药相关［6］：①ATP结合盒转运子（ATP binding cassette transporters，ABC；CDR 编码），依赖ATP主动运输。研究推测ABC的数量为28个，主要包括CDR1p和CDR2p，其编码基因分别为CDR1和CDR2。唑类耐药白念珠菌中CDR1转录增加与CDR1 m RNA稳定性增强，引起CDR1的过表达，而CDR1p通过介导脂质的移位、外排唑类药物而发挥其耐药作用［7］。目前已证实CDR1与或CDR2过表达与白念珠菌对唑类的耐药相关［8］。White等（1997）研究同一亲本的16株白念珠菌，发现耐药白念珠菌的CDR mRNA水平明显升高，认为白念珠菌的耐药与CDR家族中成员有关。Sanglard等（1997）研究发现白念珠菌被敲除CDR1基因后，表现为对唑类药物高度敏感，在前者菌株基础上进一步敲除CDR2基因后，对唑类药物的敏感度进一步提高。②主要易化子超家族（major facilitators superfamily，MFS；MDR 编码），属非能量依赖型载体，通过电化学势能进行被动转运。在白念珠菌中，它至少包括Ca MDR1p和FLU1p，编码基因分别为Ca MDR1和FLU1。白念珠菌的MDR1的过量表达是白念珠菌对氟康唑耐药的另一个主要机制［9］。白念珠菌和酿酒酵母菌中FLU1基因氨基酸序列与Ca MDR1类似，其基因缺失突变株对唑类药物敏感性增强，但其在敏感株与耐药株中表达无明显差异［10］。White（2002）亦证实FLU1基因与白念珠菌对唑类药物的耐药性及ERG11高表达无关。说明了FLU1对菌株耐药无明显影响。

2．1．2 外排泵的调控 ①转录因子Ca Tac1（transcriptional activator of CDR genes）控制着外排泵CaCdr1p、CaCdr2p的表达。Ca Tac1获得功能性突变可导致CDR1、CDR2的高表达，CDR1缺失突变株对氟康唑、伊曲康唑、酮康唑耐药性分别降低6、4、8倍，而CDR2缺失突变株对氟康唑或酮康唑耐药性降低1．5倍，对伊曲康唑没有影响，因此认为CDR1在白念珠菌对唑类药物的耐药性上发挥主要作用，而CDR2作用轻微［11］；②白念珠菌钙－钙调蛋白（Ca2＋－Ca M）依赖性途径参与耐药的调节。Ca M抑制剂吩噻嗪类能抑制白念珠菌Ca M编码基因Ca MDR1表达Ca MDR1p，使Ca MDR1p对靶蛋白钙调神经磷酸酶作用减弱，锌指转录蛋白CRZ1p的活化减弱，使白念珠菌对唑类药物敏感性增加。实验证明Ca M抑制剂能够增强酮康唑抗白念珠菌活性［12］。③ 转 录 因 子 MRR1 （multidrug resistance regulator）能上调耐药的白念珠菌的MDR1，MRR1是MDR1关键的转录因子，MRR1的失活将导致MDR1表达水平和耐药性下降［13］；④外排泵调节因子1（regulator of efflux pump 1，REP1）的过表达使菌株对氟康唑敏感性增加，而REP1基因突变引起MDR1 mRNA过表达，导致白念珠菌对氟康唑的耐药性增加。因此，Rep1p为白念珠菌MDR1的负性调控因子［9］。

2．2 靶酶的变化

2．2．1 靶酶及其编码基因 麦角固醇是真菌细胞膜上最常见的固醇，唑类药物与麦角固醇合成途径中的关键酶细胞色素P450羊毛固醇脱甲基酶（ERG11编码）结合，抑制麦角固醇的合成，从而抑制真菌的生长。当靶酶过度表达或突变时，真菌便表现出对唑类药物的耐药性。已经证实与耐药相关的靶酶基因为ERG11（或称为ERG16、CYP51A1）。Ribeiro等［14］通过比较氟康唑敏感株与耐药株，发现ERG11的上调与氟康唑诱导耐药有关。而Wang等［15］通过锁式探针和滚环扩增（rolling cycle amplification，RCA）方法快速检测白念珠菌ERG11基因的突变位点，筛选到G464 S、G448E、G307S、K143R、Y123H、S405F 、R467K 、G450V 氨基酸位点置换导致白念珠菌对氟康唑敏感度下降。Feng等［16］的研究认为F72S、F145I和G227D氨基酸位点置换与白念珠菌对唑类的耐药高度相关。

2．2．2 靶酶编码基因调控 在靶酶基因水平调控方面，锌指转录因子Upc2p是固醇生物合成和唑类耐药的重要调节因子。UPC2介导麦角固醇生物合成基因的上调，可导致白念珠菌对唑类药物的耐药性。白念珠菌UPC2基因缺失致其对唑类药物酮康唑、氟康唑的敏感性增加［17］，而UPC 2基因的G648D或A643T功能获得性突变则导致ERG11过度表达，使白念珠菌对唑类药物的耐药增加［18］。Upc2p直接结合ERG基因的启动子从而调控ERG2、ERG11基因的表达［17］。

2．3 生物膜的形成

2．3．1 生物膜及其耐药性 单个真菌粘附到底物表面，成为微菌落，依靠菌毛及富含多聚糖的细胞外基质（ECM）融合产生复杂的三维结构，形成生物膜。生物膜内包括酵母细胞、菌毛、假菌毛。白念珠菌生物膜早期为0～11 h，细胞开始粘附到底物上；中期为12～24 h，芽生孢子聚集增殖形成群落，产生富含碳水化合物的ECM；成熟期为31～72 h，细胞完全包被于ECM中，72 h后细胞开始死亡，生物膜结构开始分解。Uppuluri等［19］研究发现，白念珠菌生物膜相较悬浮相对氟康唑的耐药性提高1 000多倍。

2．3．2 生物膜耐药机制 生物膜的形成机制尚不清楚。Mukherjee等（2004）认为，在生物膜形成初期，白念珠菌外排泵的表达与其对唑类药物的耐药有关，外排泵基因的敲除不影响突变株生物膜的形成；在生物膜中后期，细胞膜固醇的改变与生物膜对唑类药物耐药有关。然而，LaFleur等［20］研究白念珠菌成熟期生物膜时，结果发现野生型与外排泵基因的缺失突变株对抗真菌药的MIC值一致，因此否定了外排泵对耐药性的影响，证实白念珠菌生物膜多药耐药性主要是由于新亚群的耐药株的出现，并确定耐药株为表型突变而不是基因突变。由此可见外排泵的改变不是生物膜形成的单一因素，其它的相关蛋白与信号通路亦参与了生物膜的形成。Seneviratne等［21］以蛋白质组学技术比较白念珠菌生物膜相与悬浮相全组蛋白，发现生物膜的形成与烷基过氧化氢还原酶、硫氧还蛋白及其过氧化物酶等氧化应激防御蛋白的上调有关。神经钙蛋白抑制剂FK506联合氟康唑可有效抑制生物膜形成，此结果间接说明了神经钙蛋白信号通路与生物膜形成有关［19］。

2．4 ERG3基因的改变 ERG3基因的突变引起固醇△5，6去饱和酶（sterol delta 5，6 desaturation）缺失，导致14－甲基粪甾醇（14－methylfecosterol）积累，而其可以支持真菌细胞生长，因此，ERG3的突变可引起白念珠菌对唑类药物的耐药性。Yan等［22］研究发现ERG3基因D19E氨基酸位点变化，引起ERG3基因失活，导致白念珠菌对氟康唑产生耐药性。Efg1负性调控ERG3基因的表达从而介导白念珠菌对唑类药物的耐药性［23］。Hsp90在一定程度上调节ERG3基因的变化。Hsp90是一种分子伴侣，在靶蛋白的折叠、转运、成熟、降解的过程中起调节作用。Hsp90具有类似“电容器”的功能，能够储存和释放基因的变异。Hsp90能够储存隐性的基因变化，当“电容器”的缓冲功能被抑制时，新的表型就会出现。Cowen和Lindquist［24］研究发现高水平的Hsp90通过快速选择诱导和维持白念珠菌和酿酒酵母对氟康唑的耐药性。Hsp90主要与底物钙调磷酸酶（calcineurin）作用引起ERG3基因的突变，从而诱导真菌对氟康唑的耐药性，并且证实Hsp90抑制剂格尔德霉素（geldanamycin）和钙调磷酸酶的抑制剂环孢菌素（Cs A）能够降低真菌对氟康唑的耐药性。研究证实在依赖Hsp90的药物抵抗机制中Hsp90和钙调磷酸酶下游效应子Crz1、Hph1／Hph2参与了对唑类药物的抵抗性［25］。

2．5 细胞膜成份的改变 细胞膜固醇、磷脂和脂肪酸等成份的改变影响其流动性和不对称性，进而影响药物进入细胞，导致白念珠菌对唑类药物的产生耐药性。Loffer等（2000）比较了氟康唑敏感菌与耐药株的细胞膜成份，发现耐药株的麦角固醇含量和磷酸卵磷酯：脑磷酯比率更低，这些变化影响了细胞膜对氟康唑的摄取，引起胞内氟康唑浓度降低，导致耐药产生。同样，Mishra等［26］认为氟康唑耐药株麦角固醇低含量、而脑磷酯高含量与白念珠菌对氟康唑的耐药相关。

2．6 白念珠菌细胞周期的改变 白念珠菌的细胞周期包括G1期、S期、G2期、M期和G0态。耐唑类药物白念珠菌处于G0态时间较长，此时，SNZ1高表达静止期同源蛋白（SNZlp）。白念珠菌细胞凋亡的比率不随唑类药物存在、培养时间或生长速率而变化，保持在一个相对稳定的值，说明其凋亡受基因控制，外界因素的诱导对其影响甚微［27］。

2．7 白念珠菌染色体的改变 Selmecki等研究发现白念珠菌在氟康唑药物的存在下迅速出现等臂染色体5L（isochromosome 5L），认为白念珠菌对氟康唑的耐药性与染色体获得性非整倍性有关。等臂染色体5L通过扩增ERG11和TAC1基因引起白念珠菌对唑类药物的耐药性［28］。

2．8 多重耐药 白念珠菌对唑类药物的耐药可能涉及多重耐药机制。约85%的氟康唑耐药菌株出现CaCDR1、CaCDR2和Ca MDR1过表达的情况［29］。White（1997）等研究了一套具有同一亲本的白念珠菌，发现CDR、MDR1、ERG16在每株菌中有不同程度的表达。Perea等（2001）发现55%的氟康唑耐药白念珠菌株同时伴有ERG11点突变与外排泵（包括CDR／MDR1）上调，15%伴有ERG11与MDR1的上调，15%伴有ERG11与CDR的上调，10%伴有ERG11上调与ERG11点突变。因此，应从整体的水平理解白念珠菌对唑类抗真菌药的耐药。

3 耐药对策

目前白念珠菌对唑类药物的耐药日趋严重。为了应对白念珠菌的耐药现象，可行的策略有：①规范用药：间歇性的、长期的、低剂量的用药可导致耐药的发生，为防止耐药的产生，应杜绝抗真菌药物的不合理应用。理论上持续性的、短期的、高剂量的用药可降低耐药的发生率，然而在高选择压力下可能会出现更高耐药的菌株。②新药的开发：新药的开发是逆转耐药的重要的措施。新一代的三唑类抗真菌药伏立康唑（voriconazole）抗菌谱较广，已用于临床。卡泊芬净（caspofungin）和米卡芬净（micafungin）分别是第一个和第二个棘球白素类抗真菌药物，它们是1，3－b－葡聚糖合成酶的抑制剂，可作用于真菌细胞壁，致使细胞破裂而发挥作用，现已用于致命性的真菌感染［30］。③联合用药：联合用药包括两种抗真菌药或一种抗真菌药与一种其它药物制剂联合使用。目前被证明可行的组合有两性霉素B与5－氟胞嘧啶（5－FC）、两性霉素B与唑类、唑类与5－FC、唑类与特比萘芬（terbinafine）、唑类与环孢菌素（Cs A）等。此外，近来有研究发现汉防己甲素可在转录水平抑制外排泵及靶酶基因的表达，汉防己甲素对唑类药物抗白念珠菌有明显的增效作用［6］。④免疫调节药物的应用：治疗的成败不仅与药物而且与宿主的免疫状况有关。唑类药物可联合细胞因子治疗伴有HIV等免疫缺陷的真菌感染患者。⑤清除病灶：通过外科手段去除真菌病灶以减轻真菌的负荷，从而使宿主和抗真菌药能有效的控制真菌感染。

综上所述，临床上白念珠菌感染率较高，并且随着唑类抗真菌药的广泛使用，白念珠菌对唑类药物的耐药性不断提高，而新型的抗真菌药的开发缓慢，这已经成为临床上较为棘手的问题。如何逆转白念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药是摆在每一个医务人员面前的迫切需要解决的问题。

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