SPA金标试纸与MPAIA试剂盒检测日本血吸虫病血清抗体应用方向探讨＊

李超伟，黄 进，魏兰英，姜昌富

胶 体 金 免 疫 层 析 技 术 （colloid gold－immunochromatography assay，GICA）和磁微粒酶联免疫技 术 （magnetic particle antibody immunoassay，MPAIA）近年来被研发为日本血吸虫病诊断试剂，用于检测日本血吸虫病血清中特异性抗体［1－4］。为探索2种诊断试剂在检测人体日本血吸虫抗体中最佳应用范围与方向，本研究采用胶体金标记葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）作为显色剂代替酶标二抗显色系统、兔抗SPA抗体代替Ig作为质控线，制备SPA金标试纸条，并评价其与MPAIA试剂盒的应用效果，分析其各自优缺点，为日本血吸虫病血清抗体检测试剂的选择提供客观依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 SPA金标试纸为北京中生朗捷生物技术有限公司试生产产品（20101119），其研发由华中科技大学同济医学院病原生物学系完成；日本血吸虫抗体检测试剂盒（MPAIA）及其检测仪器由北京倍爱康生物技术有限公司提供（20100925）。

1.2 血清标本 日本血吸虫病患者血清376例（急性感染67例，慢性感染309例，病原学检测均为阳性），肺吸虫病患者血清、囊虫病患者血清、旋毛虫病患者血清、肝吸虫病患者血清各30例（病原学检测均为阳性，且来自非日本血吸虫病流行疫区），以上血清均来自华中科技大学同济医学院病原生物学系寄生虫病血清库；100例健康人血清采自华中科技大学2010级大一新生（均来自非日本血吸虫病流行疫区）。

1.3 血清检测及结果判定方法

1.3.1 SPA金标试纸 将日本血吸虫可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen ofSchistosomajaponica，Sj－SEA）、兔抗SPA抗体分别作为试纸检测线及质控线点样，并与SPA金标结合垫相黏贴，密封保存，以备检测使用。取10μL血清样本、90μL含0.5‰tween－20的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）至试纸加样孔处，可见混合后血清及缓冲液因吸附作用沿试纸扩散，发生免疫反应，10 min内观察结果。

质控线及检测线均出现红色条带，表明该样本日本血吸虫病血清抗体为阳性；仅质控线出现红色条带，表明该样本日本血吸虫病血清抗体为阴性；质控线无红色条带或色带模糊不清表明实验失败，需重新检测。

1.3.2 MPAIA试剂盒 检测及结果判定参照试剂盒说明书。取1∶200稀释的待测血清标本15 μL、异硫氰酸荧光素标记的Sj－SEA反应试剂30μL加入试管中，振荡混匀后（37±0.5）℃水浴15 min，形成抗体、抗原免疫复合物。加磁分离试剂60μL至试管中，振荡混匀后静置5 min，使磁微粒与上述免疫复合物相结合。将试管架紧扣于磁分离板上静置2 min，弃去上清。各试管添加300μL清洗液，振荡混匀，此步须重复2次。各试管加入60μL碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）标记的羊抗人IgG试剂，振荡混匀后（37±0.5）℃水浴15 min。再次将试管架紧扣放磁分离板上静置2 min，弃去上清，并重复清洗2遍。各试管中加入100μL含有单磷酸酚酞的溶液，振荡混匀后（37±0.5）℃水浴15 min。各试管中加入300μL终止液，振荡混匀后紧扣于磁分离板上10 min，用磁分离免疫测定仪读取吸光度（A550）值。

MPAIA试剂盒临界值为0.811，大于或等于临界值为阳性，小于临界值为阴性。

1.4 效果评价

1.4.1 使用SPA金标试纸和MPAIA试剂盒检测日本血吸虫病患者血清及健康人血清 根据表1所列检测结果统计分析模式，计算两种诊断试剂的灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值、阴性预测值及约登指数等指标，从真实性、可靠性及等效性等方面进行应用效果的评价。

表1 检测结果统计表Tab.1 Table for the results of the detection

（1）灵敏度（%）＝A/（A＋C）×100，反映该方法找出病人的能力。其值愈大则漏诊的可能性愈小。

（2）特异度（%）＝D/（B＋D）×100，反映该方法正确排除患病的能力。其值愈大则误诊的可能性愈小。

（3）符合率（%）＝ （A＋D）/（A＋B＋C＋D）×100，又称一致性。

（4）阳性预测值（%）＝A/（A＋B）×100，又称预测阳性结果的正确率。表明在试验结果为阳性的人中，患该病的概率。

（5）阴性预测值（%）＝D/（C＋D）×100，又称预测阴性结果的正确率。表明在试验结果为阴性的人当中，能排除该病的概率。

（6）约登指数＝（灵敏度＋特异度）－1，又称正确指数。表明该试剂发现真正病人与非病人的总能力，指数越大，真实性越高。

1.4.2 使用SPA金标试纸和MPAIA试剂盒同步检测所有日本血吸虫病患者血清、健康人血清及4种蠕虫病患者血清。运用统计学方法对结果进行检验，分析比较两试剂。

2 结 果

2.1 SPA金标试纸检测和 MPAIA试剂盒检测376例日本血吸虫病患者血清及100例健康人血清，急性感染患者血清检出率均为100%（67/67），见表2。

2.2 评价指标 SPA金标试纸和MPAIA试剂盒的灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值、阴性预测值及约登指数见表3。

2.3 2试剂同步检测所有日本血吸虫病患者血清、健康人血清及4种蠕虫病患者血清，检测结果见表4。

表2 SPA金标试纸和MPAIA试剂盒检测结果统计表Tab.2 Table for the results of the detection by colloidal gold－SPA strip and MPAIA kit

表3 SPA金标试纸和MPAIA试剂盒临床指标Tab.3 Clinical indicators of colloidal gold－SPA strip and MPAIA kit

表4 SPA金标试纸与MPAIA试剂盒检测结果的比较Tab.4 Comparisons of the detection by colloidal gold－SPA strip and MPAIA kit

经统计学处理，2种试剂检测日本血吸虫病患者血清，其结果差别无统计学意（χ2＝2.23，P＞0.05）；2法检测健康人血清，其结果差别也无统计学意义（χ2＝0，P＞0.05）；对于日本血吸虫病患者血清与健康人血清，2试剂检测结果呈高度一致（kappa＝0.88）（表4）。

对肺吸虫病患者血清、囊虫病患者血清、旋毛虫病患者血清及肝吸虫病患者血清的检测，SPA金标试纸的总交叉反应率为7.5%（9/120），MPAIA 试剂盒仅有2.5%（3/120），详见表4。

3 讨 论

理想的诊断试剂应具备灵敏度高、特异性强、操作简单快速、便于运输和保存等优点，可用于病例诊断或筛查、流行病学调查、疾病监测以及抗药性监测等［5］。本研究以病原学检测作为金标准，收集日本血吸虫病患者血清、健康人血清、4种常见蠕虫病患者血清进行检测，以评价2种免疫学诊断试剂的应用效果。

MPAIA试剂盒检测准确性较强，其检测结果的正确率高于SPA金标试纸，且漏诊及误诊的可能性也少于SPA金标试纸；对于4种常见蠕虫病的检测，MPAIA试剂盒交叉反应率较低SPA金标试纸。但经统计学分析：两者对日本血吸虫病人血清和健康人血清的灵敏度及特异度差别均无统计学意义，检测结果呈高度一致性，可认为2种诊断试剂是等效的，皆可作为理想的日本血吸虫病诊断试剂。下面分别从2种诊断试剂的实验原理和过程等方面进行分析，以评价其应用于临床检测的效果及意义。

SPA金标试纸集中了免疫学反应与色谱层析的特点，使待测血清中的日本血吸虫抗体IgG与金标SPA结合，形成金标SPA－IgG复合物，再与硝酸纤维素膜上的Sj－SEA结合，实际上对被检测的日本血吸虫抗体起到了浓缩、聚集作用，从而加快了反应速度，整个操作仅需10 min；金标SPA作为桥抗体，无种属特异性，且具有高度的稳定性及活性［6－7］；SPA金标试纸可同时进行大批量血清标本检测，无需其他仪器设备，即可直接判读结果，简单、准确，且操作简便、易于保存、价格低廉，很适合于基层卫生单位对日本血吸虫抗体进行常规实验室检测和流行病学调查［8－9］。为进一步满足临床需要，制备敏感性更高、适用范围更广的SPA以及降低交叉反应现象将是其主要研究方向。

MPAIA试剂盒是根据80年代瑞士Serono诊断中心发明的一种非同位素免疫检测技术研发的一种日本血吸虫病诊断试剂。其整个检测过程进行2步洗涤，并对血清进行稀释（1∶200），使检测本底降低；利用磁性分离技术，使整个检测系统灵敏度高、交叉反应低、特异度高；试剂盒的酶底物为单磷酸酚酞，呈色稳定，结果可靠；且试剂盒易保存，对人体无害，无放射性。与病原学检测结果的高符合率及较低的漏诊率、误诊率使MPAIA试剂盒很适于临床检验，以确诊日本血吸虫病及鉴别诊断其他蠕虫病。为了使MPAIA试剂盒能更好的满足临床多样化的需求，推广应用于基层及现场筛查，优化反应体系、降低成本、提高反应速度将是其以后长期的研究方向。

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