小鼠过敏性哮喘模型的研究进展及评价

刘 佳，郑 健，于 涛

(东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

小鼠过敏性哮喘模型的研究进展及评价

刘 佳，郑 健，于 涛

(东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

支气管哮喘(简称哮喘)是常见的慢性病，随着过敏患者的增加，小鼠过敏性哮喘模型的研究越来越重要。本文通过对近年来国内外小鼠过敏性哮喘的实验研究文献进行总结，从实验小鼠的选择、制备模型的方法及模型的评价指标等方面进行综合分析，为进一步开展哮喘研究提供帮助。

哮喘;模型，小鼠;过敏原

支气管哮喘(简称哮喘)是以气道高反应性(AHR)、黏液高分泌和气道嗜酸粒细胞(EOS)、淋巴细胞、单核细胞等多种炎症细胞浸润慢性气道性疾病。国内外已能利用这些特征复制出哮喘急慢性炎症和气道重塑等各种模型。

由于小鼠免疫遗传背景较为清楚，动物肺功能测定技术的提高，大量相关分子生物学试剂及抗体可供选用，而使得小鼠成为制备哮喘模型的首选动物。本文介绍了几种小鼠过敏性哮喘模型的制备方法，并总结了小鼠哮喘模型的评价标准。

1 小鼠品系选择

实验小鼠品系很多，常用的品系有 C57BL/6、BALB/c、A/J、CBA、NC/Nga等。其中 C57BL/6 对HDM(屋尘螨)易致敏，可用于制作由HDM诱发的过敏性哮喘模型，但有文献指出用尘螨提取液滴鼻激发NC/Nga小鼠诱发哮喘模型症状强于其他品系小鼠［1］;而 BALB/c易对 OVA(卵白蛋白)和花粉致敏产生 AHR和明显 lg E超敏反应［2］。Jonasson等［3］比较注射与吸入乙酰胆碱在 C57BL/6、BALB/c两种小鼠体内不同影响，发现在BALB/c小鼠注射比吸入方式肺阻力明显增强，而在C57BL/6没有太大差异性。

研究发现雌性小鼠比雄性小鼠能产生更显著的过敏性气道炎症［4］。Hayashi等研究显示，在OVA诱发成熟雌/雄性BALB/c小鼠的迟发性气道炎症中，雄性BALB/c小鼠其嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润的支气管-细支气管炎症没有雌性BALB/c小鼠严重，而且支气管肺泡液中炎症细胞数也较雌性少。由于品系间身体长短和胸围不同，最终得出的哮喘动物模型也各异。另有研究表明，普通级小鼠可能由于与微生物抗原接触的机会大大增加，而降低了其对变应原哮喘炎症的敏感性，因而制备哮喘模型不宜用普通级动物［5］。目前，多数选用6～8周，体重18～22 g的C57BL/6、BALB/c雌性无特定病原体(SPF级)或清洁级小鼠做小鼠哮喘模型。

2 佐剂

佐剂是一种免疫增强剂，本身可以有免疫原性，也可以不具免疫原性。常与抗原物质一起注射或预先注入机体后，影响机体免疫调节网络，使机体更早、更有效、更持久地产生免疫应答。常用的具有免疫原性的佐剂有：百日咳杆菌、结核分枝杆菌和枯草杆菌等。非免疫原性佐剂有：Al(OH)3(氢氧化铝)、液态铝或明矾等。目前多数文献中选用氢氧化铝作为OVA致敏小鼠哮喘模型作为佐剂，但是实验中发现氢氧化铝与OVA不能很好混合，放置后出现明显分层;而佐剂与抗原混合的程度会对抗原的免疫原性的产生一定影响。田代印等用硫酸铝钾取代氢氧化铝，并用10 mol/L氢氧化钠调节pH值，使蛋白质变性，两者形成混悬小球后充分混合，增强了 OVA 的致敏效果［6］。

3 过敏性小鼠哮喘模型的制备

制作过敏性哮喘动物模型的变应原主要有OVA、尘螨、豚草、花粉、真菌孢子、蟑螂、蛔虫卵等。小鼠哮喘模型制作过程分两阶段：致敏与激发。致敏原的选择，抗原剂量、致敏和激发的时间、频率、方式不同能复制出不同的哮喘模型。即使相同诱导原致敏激发方式、间隔时间，持续时间等亦很难找到完全相同的报道。

3.1 OVA

由于OVA来源容易，价格低廉，而且具有很强的免疫原性，因此是最常用于制备哮喘模型的致敏剂。程晓明等用OVA 10 μg和氢氧化铝凝胶20 mg的混合液在第1天、第13天腹腔注射致敏BALB/c小鼠，第25天以1%OVA雾化激发20～30 min，制出急性哮喘模型［7］。最短成模过程包括在第1、8天致敏、第18～21天激发，需时21 d;经典成模过程为在第 1、15 天致敏、第 25 ～29 天激发，需时 28 d［8］。但这类小鼠模型抗原激发的时间较短，多不超过1周，此类模型的不足之处在于产生的是缺乏黏膜的慢性炎症、平滑肌增生、胶原增厚和气道壁结构改变。因此可通过长时间反复雾化激发建立重症哮喘模型。Maud等在第1、11天用OVA 10 μg和乳化氢氧化铝凝胶腹腔注射 BALB/c小鼠，第22～96天，用1%的OVA雾化激发，每周5次每次30 min，建立了小鼠气道重塑模型，并进一步研究长效土霉素通过调节基质金属蛋白酶及细胞因子对小鼠气道重塑模型的作用［9］。

致敏多采用腹腔注射、皮下注射或两者结合，越早致敏，越易成模［10］。激发方式多采用滴鼻激发或雾化激发。滴鼻激发操作方便，无需使用特殊装置，有人通过一次滴鼻方式成功建立小鼠哮喘模型［11］，但易致死。雾化激发小鼠状态较好，激发致死率低，但一次不能激发哮喘模型，需通过多长反复激发的方式建立模型。致敏原通过改变剂量影响细胞因子的类型，进而影响动物模型表型的变化。低剂量抗原进入体内，以Th2型细胞因子分泌为主，引起肺内嗜酸粒细胞聚集、粘液过度分泌等哮喘特征性表现。高剂量的抗原致敏时，诱发以Th1型细胞为主的反应，抑制了哮喘症状的出现。商艳等采用不同剂量(0、10、100、1 000)g的 OVA致敏，反复激发后建立哮喘小鼠模型，发现10 g组出现支气管哮喘的典型特征，增加致敏的剂量反而减轻了肺部炎症的程度［12］。

3.2 尘螨和蟑螂

尘螨是我国哮喘患者最常见过敏原之一，50%以上过敏患者和80%以上哮喘儿童对螨虫过敏原过敏［13］。粉尘螨与屋尘螨都是哮喘患者常见的过敏原。目前，国内外主要使用屋尘螨构建变态反应性炎症模型，粉尘螨较少。Tournoy等用不同浓度屋尘螨(3、30、300 μg/mL)连续 7 d 雾化激发，发现300 μg/mL组出现 AHR，大量炎症细胞浸润，血清IgE 升高。3 μg/mL 和30 μg/mL组出现 AHR，血清IgE 升高，但无气道炎症［14］。陈华夏于第 1、3、5、7、9、11天分别腹腔注射 200 μL 含 50 μg粉尘螨蛋白和2.25 mg氢氧化铝的生理盐水溶液致敏小鼠：第13、16、19、20 和 21 天分别用 l mL，4 g/L 的粉尘螨提取液反复雾化激发，成功建立了肺部变态反应性炎症模型［15］。Nicholas等［16］研究发现，使用尘螨、豚草等不同致敏原联合作用反复激发雌性BALB/c小鼠，建立小鼠气道重塑模型。另外Narala用蟑螂变应原致敏激发 BALB/c小鼠，成功建立哮喘模型［17］。Gore等利用基因重组蟑螂蛋白致敏也成功制作了哮喘模型［18］。

3.3 真菌和花粉

真菌和花粉是引起季节性哮喘的重要变应原，且在环境中分布广泛。互隔交链孢霉菌容易致敏，是诱发人类哮喘发作的主要霉菌种类之一。徐用选用C57BL/6小鼠腹腔注射含有4 mg氢氧化铝的浓度为4×107/mL的孢子悬液50 μL，在第14～17天，取50 μL浓度为4×106/mL的孢子悬液缓慢鼻滴小鼠，发现小鼠气道顺应性降低、反应性增高，血清总lgE和抗原特异性IgE升高，炎性细胞浸润;免疫反应机制上表现为细胞因子 IL-4升高，INF-γ降低等［19］。

皮下致敏及经鼻吸入花粉能诱导小鼠模型产生特异性IgG、IgE抗体、细胞因子、肺部组织炎症浸润、黏液分泌以及非特异性气道高反应性等［20］。

4 小鼠哮喘模型的一般评价指标

哮喘模型是气道高反应性和炎症细胞浸润为特征慢性气道炎症性疾病，因此，一个理想的哮喘模型应从动物的症状表现、气道反应性及病理学改变3个方面来验证。判断哮喘模型是否成功和合格至少应当包括以下4个方面：

4.1 造模后动物总体外观

小鼠腹腔致敏后出现体重下降，经抗原激发后出现烦躁不安、擦鼻、打喷嚏、呼吸困难或呼吸节律不整、腹肌抽搐、口唇紫绀伴腹式呼吸、毛发竖起、反应迟钝等症状。

4.2 肺病理切片观察、炎症细胞浸润、炎性细胞分类(以EOS为代表)

可进行苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘碱性蛋白(MBP)染色、刚果红染色观察肺组织中炎症细胞，尤其是EOS浸润。A.P.Rogerio等通过苏木精-伊红(HE)染色法观察炎症细胞浸润［21］。何胜东等通过碘酸雪夫(PAS)或阿新蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色观察气道黏液的产生［22］。Masson三色染色主要是观察胶原沉积。

4.3 BALF中细胞组分的测定

魏国会等收集BALF液，离心(3 000 r/min)10 min，弃去上清液，沉淀细胞加0.2 mL缓冲液混悬。吸取0.1 mL于血球计数板上，显微镜下计白细胞总数;吸取0.01 mL涂片，瑞氏染色后计嗜酸性粒细胞(EOS)数(至少计数200个细胞)。也可将BALF通过甩片机制备成细胞涂片，进行瑞氏-吉姆萨染色或Diff-Quick染色，计数细胞总数并进行分类计数。

4.4 生理功能指标

气道对各种刺激物的高度敏感状态，称为气道高反应性［24］。目前采用的有离体气道平滑肌收缩力测定法、有创的肺阻抗或气道峰压测定法和无创整体体积描记法。其中整体体积描记法是根据哮喘时呼气相时间延长、表现为呼气末暂停时间延长即为增强的呼气间歇(enhanced pause，Penh)的现象来定量反映气流受限程度［25］。该方法优点在于可使小鼠在清醒状态下测定气道反应性，并通过雾化吸入给予气道收缩剂，是更接近人类气道反应性测定方法，且操作方法较有创方法简单。Penh并不是反映气道阻力的一个直接指标，但它与有创条件下测得的气道阻力、跨肺压等指标有很好的相关性，且不受小鼠呼吸频率影响。目前该方法是最被认可的小鼠气道反应性测定方法，但有研究认为该指标也有缺陷，很多情况下不能真正反映气道反应性［26］。

此外，分子水平评价指标越来越受到学者们的重视。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定BALF 中细胞因子(如 IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、INF-γ)和血清总lgE、抗原特异 IgE含量测定，使人们对小鼠哮喘模型机理有了更加深入的了解。Won-Kyo Jung等末次激发24 h后，处死小鼠离心肺泡灌洗液，取上清液通过 ELISA 测定 IL-4、IL-5、IFN-γ、and、TNF-α含量［27］。苏新明等通过测定血清总 IgE和OVA特异性IgE水平检测是否成功建立小鼠哮喘模型［28］。

综上所述，小鼠哮喘模型的建立受到多因素如遗传背景、佐剂的选择、致敏原的剂量与时间的控制，人们可根据自己要求建立不同的哮喘模型。但对模型建立的标准至今没有量化，只是根据对哮喘本质的认识而评价出至少要有气道高反应性和炎症细胞浸润这两大特征。此外，虽然小鼠哮喘模型在哮喘发病机理及新药的研发中发挥重大作用，但仍具有一定的弊端：一方面人类器官远比小鼠器官复杂得多，很多实验结果表明，人类哮喘和小鼠哮喘模型在许多方面如血浆蛋白渗出等有很大差异;另一方面，小鼠哮喘模型是在实验室中通过人为刺激建立，与人类实际的哮喘发病情况有不同。

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Progress and Evaluation of Research on Mouse Models of Allergic Asthma

LIU Jia，ZHENG Jian，YU Tao
(Alkali Soil Natural Environmental Science Center，Northeast Forestry University/Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field，Ministry of Education，Harbin 150040，China)

Bronchial asthma(asthma for short)is a common chronic disease.With the increase of allergic patients，it is increasingly important to emphasize the need of mouse allergic asthma models in research of this disease.This review summarizes recent domestic and overseas literatures on mouse allergic asthma experiments through comprehensive analysis on mouse selection，models making and model evaluation.

Asthma;Model，Mice;Allergen

R562.2+5;R33

A

1671-7856(2011)02-0065-04

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.15

2010-09-16

刘佳(1981-)，女，硕士研究生，细胞生物学专业，E-mail：hlelj@sina.com。

于涛(1969-)，男，讲师，从事生物化学方向研究，E-mail：yangwang0815@126.com。