线粒体DNA编码蛋白质亚基的研究

陈飞雄申林娜蒲 军徐 蔚

（1 昆明医学院第二附属医院神经外科，云南 昆明 650101；2 昆明医学院第二附属医院神经内科，云南 昆明 650101）

线粒体DNA编码蛋白质亚基的研究

陈飞雄1申林娜2蒲 军1徐 蔚1

（1 昆明医学院第二附属医院神经外科，云南 昆明 650101；2 昆明医学院第二附属医院神经内科，云南 昆明 650101）

人类线粒体DNA（mtDNA）是全长为16569 bp的双链闭环分子，除负责编码2种rRNA和22种tRNA外，还参与了4种呼吸酶复合物（13种多肽）的形成。包括NADH-CoQ还原酶（NADH-CoQ reductase，ND）中的7个亚基（ND1-6，4L）；泛醌-细胞色素C还原酶（CoQ-Cytc reductase）的1个亚基（Cyt-b）；细胞色素C氧化酶（cytochrome Coxidase,COX）中的3个亚基（COX I–III）；ATP合成酶（ATPase）中的2个亚基（ATPase6，8）。本文就人线粒体DNA编码的各蛋白亚基的结构、功能和研究进展进行综述。

线粒体基因组；线粒体；NADH-CoQ还原酶；泛醌-细胞色素C还原酶；细胞色素C氧化酶；ATP合成酶

线粒体是一种普遍存在于真核细胞中的细胞器，除了红细胞外人类所有体细胞都含有线粒体，其中多数细胞含有数以万计的线粒体。线粒体是真核生物细胞内的能量转换体系和供能中心，它含有自己的DNA。就人体来说，线粒体内的DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是核外惟一具有自己的遗传密码和蛋白质翻译系统，控制着线粒体一些基本性质。因此，线粒体除了能量转换作用，还参与了4种呼吸酶复合物（13种多肽）的形成。包括NADH-CoQ还原酶（NADH CoQ reductase，ND）、泛醌-细胞色素C还原酶（CoQ-Cytc reductase）、细胞色素C氧化酶（cytochrome Coxidase，COX）和ATP合成酶（ATPase）[1,2]。

1 线粒体基因组的构成

人类每个mtDNA约有10个基因拷贝，每个细胞包含103～104个线粒体。mtDNA是存在于线粒体内的双链闭环分子，由16569bp组成，双链中一条为重链（H），一条为轻链（L）。这是根据它们的基因产物在CsCl中的密度的不同而区分的，两条链均具有编码功能。它除了有DNA外，还有自己的蛋白质合成系统，因为它有22个tRNA基因和2个rRNA基因以及核糖体等。mtDNA蛋白质编码基因的12/13是由mtDNA的重链转录的，所编码的13个蛋白质为：细胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚基，NADH脱氢酶的ND1-6和ND4L亚基，细胞色素b以及ATP酶6、8亚基[2]。其复制和转录的起始点位于D-loop区（16028～577np）。mtDNA转录与nDNA不同步，其64个密码子中有4个与核基因组不同[3,4]。在mtDNA，除了一小段D环区域外，其他序列无内含子，因此任何mtDNA的突变都会影响到其基因组内的重要功能区域，从而影响线粒体功能。

2 mtDNA编码的蛋白质亚基的结构与功能

2.1 mtDNA编码ATP合酶亚基

mtDNA编码ATP合酶亚基的是F0亚基中的ATPase6和ATPase8。ATPase6基因存在于所有生物中，但是细菌、植物的线粒体基因组不包含ATPase8基因，这与一般后生动物有所不同。在人的线粒体基因中，ATPase6和ATPase8 2个基因相邻并重叠45bp，ATPase8基因长207bp，编码68个氨基酸；ATPase6基因长681bp，编码226个氨基酸[5-8]。

mtDNA ATPase8和ATPase6是调控能量合成的重要基因，mtDNA ATPase8和ATPase6表达异常会导致线粒体能量合成障碍进而加速细胞凋亡。柏干荣等[5]研究发现，在失血性休克肠上皮细胞mtDNA的ATPase6基因测序研究中发现缺血缺氧时存在碱基突变及编码氨基酸的改变，进而影响F1F0-ATPase蛋白的功能和ATP的合成。李玮等[6]通过研究发现脑出血后血肿周围水肿组织线粒体ATPase-6基因表达开始下降，至第7d时ATPase6基因表达明显下降，这一结果提示脑出血可有足够能量供应促使细胞发生凋亡。张莹等[7]研究发现，长时间的缺血缺氧使mtDNA的ATPase6、ATPase8编码基因改变，继之其转录下调，导致细胞氧化磷酸化缺陷并加速细胞凋亡的发生。ATPase6基因位于8993位点的核酸突变会引起神经病学性肌无力、运动失调和色素性视网膜炎综合[8]。洪灯等[9,10]通过研究成功构建了pG-PH1/GFP/ Neomouse-shATP8 RNA干扰质粒，为下一步进行ATP ase8基因RNA干扰在卵母细胞发育成熟中的作用奠定基础。并用RT-PCR检测GV期单个卵母细胞中ATPase8基因的表达，发现小鼠GV期卵母细胞特异表达的ATPase8基因可能与卵母细胞的正常发育成熟相关。

2.2 mtDNA编码的细胞色素氧化酶亚基

COXⅠ亚基、COXⅡ亚基、COXⅢ亚基由mtDNA编码。其中COXⅠ亚基基因总长约1542bp，编码513个氨基酸，与血红素a1、血红素a3和CuB结合；COXⅡ亚基基因总长约684bp，编码227个氨基酸，与CuA结合，位于线粒体胞质面与细胞色素C进行反应[11]；COXⅢ亚基基因总长约781bp，编码260个氨基酸，参与氧化还原连接的质子易位过程，起调节作用。COXⅠ为mtDNA编码的3个亚基中最大的一个，与COXⅡ一起构成细胞色素氧化酶的活性中心[12]。

在不同的组织线粒体COX的活性存在着很大差异，按活性大小排列依次是心脏、肝、肾和脑组织等。近年来有报道，心脏和脑缺血缺氧后会表现相应区域COX活性下降，COX表达改变。Abe等[13]报道，在短暂缺血最敏感的CAl区缺血3min后再灌，沙鼠该区的COX在3h出现下降，8h时更明显，且进行性加重。提示C0X活性的下降可能是细胞能量代谢障碍的重要原因。顾卫东等[14]研究发现，低温可通过保护C0X活性减轻脑缺血/再灌注期间的细胞能量代谢障碍，从而减少延迟性神经元死亡（DND）。

Wang等[15]认为，正常细胞mtDNA的转录水平降低、细胞凋亡增高，使得细胞程序性死亡，而mtRNA的增高可降低细胞凋亡，可能与细胞的癌变有关。并且Lu等[16]指出不同的肿瘤可能出现mtDNA不同的基因表达的改变。Parrella等[17]研究发现乳腺癌患者COXⅡ的表达比正常组织明显增高。韩波等[18]应用RT- PCR方法发现胃癌组织线粒体COXⅠ和ND4的转录水平显著高于远癌正常胃黏膜组织。癌变组织线粒体COXⅠ和COXⅡ的增高可能是肿瘤细胞为满足自身能量需求的一种适应性反应，线粒体可能通过凋亡途径参与肿瘤形成的过程。

高静等[19]研究发现COXⅢ在癫痫急性期表达显著升高，静止期降至对照水平，而慢性期则显著降低。说明急性痫性发作诱发该亚单位的重新合成，而慢性期长期自发性孤立的发作则不足以诱导该亚单位的重新合成，反而破坏其合成机制；并发现COXⅢ基因和蛋白的改变与海马神经元丢失所导致的线粒体含量下降是无关的，可能的机制是活性氧簇机制。

2.3 mtDNA编码的泛醌-细胞色素C还原酶亚基

细胞色素b（Cyt-b）是mtDNA编码的蛋白质。Cyt-b是一个横贯膜两侧的极端疏水性的蛋白，并与内膜结合，含两个血红素b562/bH和b566/bL。Cyt-b基因序列全长为1135bp，编码378 个氨基酸和一个终止密码子。 对Cyt-b氨基酸组成和结构基因的DNA顺序研究指出，约68%的氨基酸为非极性的。对Cyt-b在电子传递链中的复杂功能至今还不清楚。

研究家兔在单纯疱疹病毒感染的潜伏期神经系统中基因的表达情况，发现Cyt-b的编码基因下调表达[20]。Cyt-b在甲状腺乳头状癌细胞中呈高表达[21]。郭丽君等[22]用PCR法扩增、荧光DNA测序，发现糖尿病组线粒体Cyt-b基因持有多数的单核苷酸多态性（SNPs）是有害的。张默函等[23]研究发现mtDNA Cyt-b的mRNA表达水平在乳腺癌组织较癌旁组织高，mtDNA Cyt-b基因在乳腺癌组织中转录水平的上调，可能是肿瘤细胞为满足自身能量需求的一种适应性反应，但是具体机制尚不清楚，尚有待进一步研究。

由于Cyt-b基因在线粒体基因组中进化速度适中，而且在一定的进化尺度内Cyt-b基因不受饱和效应的严重影响，所提供的系统发育信息和遗传分化水平适于分析种间和属间差异。所以Cyt-b成为研究种内或近缘种间系统发育和遗传问题最常用的工具之一，它的部分或全序列被广泛应用于动物类群的系统进化和分类研究中。付小全等[24]发现萍乡肉红鲫与其他鲫鱼类的Cyt-b基因具有较高的同源性，与普通鲫鱼的相似性为98%，萍乡肉红鲫与普通鲫鱼亲缘关系最近。

2.4 mtDNA编码的NADH还原酶亚基

NADH还原酶疏水部分的7个亚基ND1-ND6和ND4L由mtDNA编码[25]。在人的线粒体基因中，ND1基因长957bp，编码318个氨基酸；ND2基因长1042bp，编码347个氨基酸；ND3基因长346bp，编码115个氨基酸；ND4基因长1378bp，编码459个氨基酸；ND4L基因长297bp，编码98个氨基酸；ND5基因长1812bp，编码603个氨基酸；ND6基因长525bp，编码174个氨基酸；其中ND4和ND4L 2个基因相邻并重叠6bp。

李传连等[26]对弱精子症（AST）精子mtDNA ND3、ND4L基因突变检测和分析时发现线粒体单体型与精子活力可能存在一定的相关性；mtDNA 10398G-10400T多态性可能是精子活力的有益因素，mtDNA G10310A突变可能是精子活力的有害因素。李明珍等[27]研究发现线粒体基因ND4 12026A→G突变携带者的家系临床表现多样，并可能与自身免疫相关。魏佳等[28]通过直接测序检测乳腺癌、良性乳腺肿瘤散发病例外周血和乳腺组织中线粒体ND5基因变异，发现乳腺癌与良性乳腺肿瘤相比线粒体ND5基因更多的发生对线粒体功能产生影响的恶性突变，线粒体ND5基因突变与乳腺肿瘤发生发展可能存在一定相关，这种区别可能成为潜在的肿瘤诊断分子标记。李东等[29]发现mtDNA3394T→C突变与老年线粒体糖尿病的发生与发展有关，并起着重要作用。

3 展 望

近年来，随着分子生物学、基因工程、克隆技术等技术手段的发展与完善，mtDNA结构与功能的研究在分子进化、生物分类、群体遗传结构分析、亲缘关系鉴定、法医学鉴定、衰老、疾病诊断、细胞凋亡和氧化磷酸化作用机制等领域已经取得了令人瞩目的成就。在动物重要经济性状的研究方面，比如在牛的肥育性状、产奶量、乳脂率、乳蛋白含量、繁殖性状等方面也已经取得显著的成绩。在人类疾病研究中，已经发现的由mtDNA变异导致的疾病已达70多种，其中包括Parkinson综合征、Alzheimer综合征、Leber氏视神经病（LHON）、老年痴呆与舞蹈综合征（DEMCHO）、耳聋（DMDF）、癫痫（MERRF）等，因此，深入这一领域的研究，对于明确某些疾病的发病机制，寻找新的治疗药物和治疗途径及提高动物重要经济性状等方面均有重要的意义。

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The Research Progress of Protein Subunits Coded by The Mitochondrial DNA

CHEN Fei-xiong1, SHEN Lin-na2, PU Jun1, XU Wei1
(1 Department of Neurosurgery, The 2nd of Af fi liated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, Yunnan 650101,China;2 Department of Neurology, The 2nd of Af fi liated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, Yunnan 650101,China)

The total length of the human mitochondrial DNA(double loop molecular chain)was 16,569 bp, the genome content of human including 2 rRNA,22 tRNA, and 13 protein-coding genes.The 13 protein-coding genes were NADH dehydrogenase subunits 1-6 and 4L genes; cytochrome c oxidase subunits I-III genes; cytochrome b gene; ATPase subunits 6 and 8 genes; In the present review ,the composition, the structure and function, the most signi fi cant studies on the 13 protein-coding genes are reported.

Mitochondrial genome; Mitochondria; NADH-CoQ reductase; CoQ-Cytc reductase; Cytochrome Coxidase; ATPase

Q5

A

1671-8194（2011）01-0006-03

云南省自然科学基金重点项目（2003C0010Z）