空肠弯曲菌生物膜研究进展＊

张 明，黄金林，焦新安

空肠弯曲菌生物膜研究进展＊

张 明，黄金林，焦新安

空肠弯曲菌是全球范围内主要的人兽共患性、细菌性肠道病原菌之一［1］，其感染率在世界各地普遍呈上升趋势，主要引起人体急性肠炎和食物中毒，并伴发反应性关节炎、肝炎、瑞特氏病和格林－巴利综合征等免疫性损伤性疾病［2］。生物膜是指微生物在生长过程中为适应生存环境而吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌黏性胞外基质（extracellular polymeric substance，EPS）将其自身包裹成微菌落，并相互融合形成的高度组织化、系统化的微菌落膜性聚集物［3－4］。生物膜的形成在空肠弯曲菌传播感染中扮演了重要的角色［5］，因此对于空肠弯曲菌生物膜基础的研究具有重要的意义。本文对空肠弯曲菌生物膜的形成、相关基因、检测分析方法、研究展望作了综述。

1 空肠弯曲菌生物膜的形成

1．1 空肠弯曲菌生物膜的形成条件 空肠弯曲菌是世界范围内主要的食源性病原菌，与多数肠道细菌类似，在环境中主要以生物膜形式存在。温度、氧气、营养条件、吸附材料等环境条件都会影响空肠弯曲菌生物膜的形成［6］。Reeser等［5］定量测定了空肠弯曲菌在不同培养基、不同培养温度以及不同吸附材料表面生物膜的形成能力，研究表明在37℃条件下培养在MH肉汤中的空肠弯曲菌生物膜形成能力较高，当在培养基中添加葡萄糖、蔗糖、NaCl等都会减弱空肠弯曲菌生物膜的形成；而在不同的材料表面空肠弯曲菌形成生物膜的能力也不同，相对而言其更容易吸附在疏水材料表面形成生物膜。Reuter等［7］发现微需氧性（5%O2，10%CO2）的空肠弯曲菌在高的氧气浓度下更有利于生物膜的形成。有学者通过研究空肠弯曲菌在可控制的混合微生物环境中的生物膜形成，发现不同的微生物环境能够影响空肠弯曲菌生物膜的形成，如粪肠球菌和溶血性葡萄球菌能够联合空肠弯曲菌在微需氧条件下形成生物膜［8－9］。

1．2 空肠弯曲菌生物膜形成过程 空肠弯曲菌的生物膜形成是一个复杂的过程，也是个动态的过程［10－11］。总体包括粘附、增殖、成熟三个阶段。首先，浮游细胞接受环境的营养信号，对宿主表面进行特异性的粘附，其中涉及到一些基因的表达以及蛋白的识别作用［12］，在这个阶段单个附着的细胞仅由少量胞外聚合物包裹，研究显示这些附着的细菌还未进入生物膜的形成过程，很多菌体还可以重新进入浮游生活方式，因而粘附的过程是可逆的［13］。当细菌粘附到表面后，就开始大量繁殖进入增殖阶段，在这个阶段菌体自身分泌大量的黏性胞外基质［14］，细胞间互相粘附形成微菌落，此时细菌的抗性提高。最后，细菌在粘附表面形成的多个微菌落互相融合，继续发展，形成彼此间有液体通道相连的成熟的细菌生物膜［15］。而生物膜的形成又是一个循环的过程，成熟生物膜上的一些细菌可以脱落到浮游环境中，又转变成浮游生长状态经历新的循环［16］。

2 空肠弯曲菌生物膜形成过程中的基因调控研究

空肠弯曲菌生物膜的形成过程牵涉到多种基因的表达以及复杂的调控机制，目前对空肠弯曲菌生物膜的研究主要集中在对已知基因进行缺失突变来探索对生物膜形成的影响规律。Asakura等［17］研究了有关细胞间结合蛋白Peb4（CBF2）对空肠弯曲菌生物膜的影响，研究表明Peb4突变株无论是在微需氧还是在有氧条件下，生物膜的形成都有一定程度的减弱。Reeser等［5］研究发现鞭毛在空肠弯曲菌生物膜形成过程中具有重要的作用，其鞭毛突变株与野生菌株相比形成生物膜能力较弱。另外，群体感应调节系统（Quorum sensing）也参与生物膜形成整个过程，细菌通过群体感应信号分子与周围环境进行交流，从而影响生物膜的形成［18］。研究表明空肠弯曲菌的有关群体感应信号分子基因lux S在空肠弯曲菌生物膜的形成中起到重要的作用，lux S的突变株与野生株比较，生物膜形成能力有较大程度的减弱［19－20］。Fields等［21］研究发现 Csr A 是空肠弯曲菌生物膜形成中的一个催化因子，其csr A突变株只形成了相当于野生株一半的生物膜，而回复株生物膜的形成能力又是野生株的2倍左右。Niou等［22］研究了有关多糖合成的基因gal E对生物膜形成的影响，发现其过量表达会较大程度提高空肠弯曲菌生物膜形成的能力。

3 空肠弯曲菌生物膜的检测分析方法

近年来随着对生物膜研究的不断深入，出现了多种对生物膜的检测方法，主要包括染色法（刚果红染色法、银染法、结晶紫染色法等）和显微镜观察法。实验中可根据不同的生物膜成分选择不同的方法来进行检测，由于目前对空肠弯曲菌生物膜的成分缺乏了解，对其检测分析就主要包括常规的结晶紫染色法和显微镜观察法。

3．1 结晶紫染色法 利用生物膜内物质对结晶紫染料的结合，可以通过结晶紫染色法对生物膜进行定量检测。首先，将结晶紫溶液浸润生物膜形成的表面，静置一段时间后用水洗除去未结合的染料，然后用乙醇或乙酸溶液溶解附着于生物膜上的染料，最后用分光光度计或酶标仪测定有色溶液的吸光值［23］。Reeser等［5］利用结晶紫染色法对空肠弯曲菌生物膜的形成进行了定量测定，并对不同培养条件进行了比较。

3．2 显微镜观察法 传统的光学显微镜观察法，样品制备简单，易操作。但容易产生折射，生物膜结构损坏严重且互相重叠，很难观察到生物膜的具体结构。扫描电子显微镜（SEM）观察法，样品需经过梯度脱水，电子束不穿过样品，仅在样品表面扫描激发出次级电子而成像，图像有很强的立体感。但其样品处理过程中很可能导致样品变形，以及结构的破坏，仅仅能够观察大致的形态学。

激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察法，由于不需要样品固定和包埋技术，因此不会破坏生物膜的结构，使人们可以在第一时间直接观察新鲜、完全水合的样品。除了可以通过图像软件得到各个角度的生物膜三维视图外，更有一些计算软件可以将三维的图像数据化，从而使生物膜的特征量化［24］。

4 展 望

空肠弯曲菌是一种重要的人兽共患病原菌，目前其致病机理还不是很明确，而生物膜可能是细菌致病性的一个重要机制。近年来随着对空肠弯曲菌的研究越来越深入，对空肠弯曲菌生物膜的研究也在不断发展，空肠弯曲菌生物膜的培养条件、定量测定方法以及一些基因对其的影响也逐渐明了；但目前空肠弯曲菌生物膜的研究只局限于表型的测定和已知基因的缺失突变等，而空肠弯曲菌生物膜基础表型特征，基因间的调控表达以及形成过程中细胞信号传导机制等尚未阐明。因此今后空肠弯曲菌生物膜的研究方向应集中于生物膜形成分子调节机制、相关基因之间的表达调控以及一些控制技术领域，对于空肠弯曲菌的传播感染的控制具有重大的意义。

［1］Huang J，Yang G，Meng W，et al．An electrochemical impedimetric immunosensor for label－free detection of Campylobacter jejuni in diarrhea patients＇stool based on O－carboxymethylchitosan surface modified Fe3O4nanoparticles［J］．Biosens Bioelectron．2010，25（5）：1204－1211．

［2］Ang C W，Jacobs B C ，Laman J D．The Guillain－Barrésyndrome：a true case of molecular mimicry［J］．Trends Immunol，2004，25（2）：61－66．

［3］Donlan R M．Biofilms：Microbial life on surfaces［J］．Ernerg Infect Dis，2002，8（9）：881－889．

［4］朱莲娜，郑薛斌．细菌生物膜及其相关感染的研究进展［J］．广西医学，2001，10（23）：1102－1104．

［5］Joshua G W，Guthrie－Irons C，Karlyshev A V，et al．Biofilm formation in Campylobacter jejuni［J］．Microbiology，2006，152（2）：387－396．

［6］Reeser R J，Medler R T，Billington S J，et al．Characterization of Campylobacter jejuni Biofilms under Defined Growth Conditions［J］．Appl Environ Microbiol，2007，73（6）：1908－1913．

［7］Reuter M，Mallett A，Pearson B M，et al．Biofilm Formation by Campylobacter jejuni is increased under Aerobic Conditions［J］．Appl Environ Microbiol，2010，76（7）：2122－2128．

［8］Chavant P，Gaillard－Martinie B，Talon R，et al．A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria［J］．J Microbiol Methods，2007，68（3）：605－612．

［9］Teh K H，Flint S，French N．Biofilm formation by Campylobacter jejuni in controlled mixed－microbial populations［J］．Int J Food Microbiol，2010，143（3）：118－124．

［10］汪仁莉，张玉玲，张成．细菌生物膜的研究进展［J］．宁夏农学院学报，2003，24（4）：77－79．

［11］Sutherland I W．The biofilm matrix－an immobilized but dynamic microbial environment［J］．Trends Microbiol，2001，9（5）：222－227．

［12］Stenstrom T A，Kjelleberg S．Fimbriae mediated nonspecific adhesion of Salmonella typhimuriun to mineral particles［J］．Arch Microbiol，1985，143（1）：6－10．

［13］O＇Toole G A，Kolter R．Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development［J］．Mol Microbiol，1988，30（2）：295－304．

［14］Lewis K．Riedle of Biofilm Resistanle［J］．Antimicrob Agents Chemother，2001，45（4）：999－1007．

［15］Wimpenny J，Manz W，Szewzyk U．Heterogeneity in biofilms［J］．FEMS Microbiol Rev，2000，24（5）：661－671．

［16］Otto M．Virulence factors of the coagulase－negative staphylococci［J］．Front Biosci，2004，9（1）：841－863．

［17］Asakura H，Yamasaki M，Yamamoto S，et al．Deletion of peb4 gene impairs cell adhesionand bioflm formation in Campylobacter jejuni［J］．FEMS Microbiol Lett，2007，275（2）：278－285．

［18］David G D，Matthew R P，James P P，et al．The involvement of cell－to－cell signals in the development of a bacterial biofilm［J］．Science，1998，280（4）：295－298．

［19］Cloak O M，Solow B T，Briggs C E，et al．Quorum Sensing and Production of Autoinducer－2 in Campylobacter spp．，Escherichia coli O157：H7，and Salmonella enterica Serovar Typhimurium in Foods［J］．Appl Environ Microbiol，2002，68（9）：4666－4671．

［20］Elvers K T，Park S F．Quorum sensing in Campylobacter jejuni：detection of a luxS encoded signalling molecule［J］．Microbiology，2002，148（5）：1475－1481．

［21］Fields J A，Thompson S A．Campylobacter jejuni Csr A Mediates Oxidative Stress Responses，Biofilm Formation，and Host Cell Invasion［J］．J Bacteriol，2008，190（9）：3411－3416．

［22］Niou Y K，Wu W L，Lin L C，et al．Role of galE on biofilm formation by Thermus spp［J］．Biocheml Biophys Res Commun，2009，390（2）：313－318．

［23］Pratt L A，Kolter R．Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation：roles of flagella，motility，chemotaxis and type I pili［J］．Mol microbiol，1998，30（2）：285－293．

［24］林丽华，余加林．铜绿假单胞菌生物膜研究进展［J］．中国微生态学杂志，2008，12（20）：607－608．

R378．99

A

1002－2694（2011）10－0933－02

＊国家自然科学基金（31072150）、国家支撑计划（2009BADB9B01）

焦新安，Email：jiao＠yzu．edu．cn

扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室，扬州 225009

2011－03－29；

2011－06－25