常用病毒载体的基础研究及临床应用

潘志敏，马 勇，程细高

(南昌大学 第一附属医院，江西 南昌 330006)

基因治疗是指能将外源基因导入靶细胞并有效表达从而实现治疗疾病的一种疗法。如何选择高效、低毒、靶向性强的载体，以协助目的基因进入靶细胞并正确表达，是基因治疗过程中必须解决的问题［1-2］，也是基因治疗研究领域的核心技术之一。基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体两类［3］。病毒载体具备传送其携带的基因组进入其他细胞并进行感染的分子机制［4］，包括逆转录病毒(Retrovirus，Rv)、腺病毒(Adenovirus)、慢病毒(Lentivirus，Lv)、腺相关病毒(Adeno associated virus，AAV)及杆状病毒(Baculovirus)等。

1 Rv载体

1.1 Rv及其载体的结构

Rv在逆转录酶的作用下能将RNA转变成cDNA的单链RNA。其产物cDNA可进入细胞核并整合在染色体中随宿主细胞的增殖而转录翻译。Rv的RNA基因组核心部分含三个开放读码区:gag-编码病毒核心蛋白，PoL-编码逆转录酶，env-编码病毒被膜蛋白［5］。利用这些结构可将Rv设计成一种复制缺陷性病毒，使其能携带某些目的基因。

1.2 Rv载体的优缺点及改良

Rv载体的优点有:(1)宿主范围广，对细胞感染率可高达100%;(2)能持久表达目的基因;(3)有强启动子，能高效稳定表达外源基因;(4)感染细胞不产生病变。Rv载体也有不足:(1)只能整合至分裂期细胞;(2)插入诱变，引起机体免疫反应;(3)双嗜性Rv载体也不能解决感染特异性靶细胞问题。针对这些问题，研究者们不断寻找解决方案:Roux等曾提出用双特异性分子桥来解决感染特异性靶细胞问题。此分子桥既可与病毒颗粒结合，也可与特异细胞表面受体结合，从而引导病毒趋向特异性靶细胞。为提高Rv载体的转染率，也有人提出多次重复感染，用水泡性口炎病毒包膜G蛋白替代原病毒蛋白包装Rv。

1.3 Rv载体的应用

以Rv为载体的基因转移技术在基因治疗、外源基因表达和RNA干扰等方面均有广泛应用。世界上第一例基因治疗病例就是应用Rv携正常的腺苷脱氨酶(ADA)基因成功治愈了ADA缺乏症患者。随后英国奥蒙德大街医院也运用Rv作为治疗载体根治了一名患X染色体连锁重症免疫缺陷病儿童。

王韫芳等［6］利用复制缺陷型Rv和pMSCVneo成功构建了pMSCV-HGF。为进一步应用HGF基因进行干细胞工程、组织工程的研究奠定了基础。还有顾红祥等［7］将凋亡素基因(VP3)与Rv连接，构建出重组Rv凋亡素载体，用其感染人肝癌细胞系HepG。发现它可在四环素调控下表达VP3并诱导HepG2凋亡。此理论为肿瘤的可控性基因治疗提供了依据。此外Rv载体在治疗艾滋病［8］、神经系统疾病［9-10］等方面同样具备巨大的应用潜力。

2 腺病毒载体

2.1 腺病毒的结构

腺病毒是无包膜的线状双链DNA病毒，由壳粒呈二十面体排列构成。衣壳内的五联体及纤毛顶端形成的头节区能与细胞表面的病毒受体结合。腺病毒基因组中的蛋白VI与病毒衣壳连接在一起，在两条链的5'端各结合DNA蛋白复合物结构，其与腺病毒复制密切相关。基因组编码区分为早期基因区和晚期基因区，前者主要编码病毒的调节蛋白，后者编码病毒的结构蛋白。第三代腺病毒载体去除了所有编码基因，只保留了5'和3'末端反向末端重复序列及包装信号。因此载体容量大，可携带36 kb DNA。

2.2 腺病毒载体的改良

腺病毒载体不整合入宿主细胞染色体，插入诱变的潜在风险比Lv小，还可感染分裂期和静止期细胞，且能高效表达其基因产物。其缺点是难以持续表达，还可能诱发宿主体内细胞免疫和体液免疫反应而导致组织损伤和转基因表达［11］。对此人们研制出删除了所有编码区基因的辅助依赖型腺病毒载体，其免疫原性、炎性反应和细胞毒性均明显降低。

2.3 腺病毒载体的应用

腺病毒载体宿主范围广，包装容量大，安全性好。因腺病毒能高效转染多种细胞所以常作为基因转移的载体［2］。在基因治疗和疫苗载体等方面获得广泛应用:孙士敏等［12］以脂质体为介导将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGIoxAEl、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞进行同源重组产生了重组腺病毒pAd-NS5B。成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体，为进一步探索HCV基因免疫和治疗做了铺垫。

Takeshi等［13］构建的腺病毒载体包含RNA聚合酶-Ⅰ依赖的表达盒和四环素调控系统。依据四环素应答元件和RNA聚合酶-Ⅰ启动子制备了杂合启动子，后者能促进HCV复制子进行扩增。可作为HCV复制的一个评估系统。

3 Lv载体

3.1 Lv的结构

Lv属逆转录病毒科，其载体以HIV-I为基础构建。Lv载体还有4个辅助基因vif、vpr、nef和vpu及2个调节基因Tat和rev。其宿主范围比Rv更广，对难转细胞其基因转染率也较高。

3.2 Lv载体的构建

Lv载体构建的关键是将HIV-I基因组中的顺式作用元件和编码反式作用蛋白序列进行分离［14］。包装成分与载体成分均含逆转录和HIV-I顺式作用序列。包装成分可分别构建在两质粒上:其一表达gag和pol，另一个表达env。

3.3 Lv载体的优点及应用

Lv载体以其高效、稳定的基因转移效率成为研究者的新宠。其优点是:(1)对分裂期和非分裂期细胞均能感染;(2)可整合入宿主细胞染色体实现长期而稳定的表达;(3)可兼容多个转录启动子［15］。

Lv载体为AIDS的基因治疗带来了福音，在其他系统疾病的治疗中也显现希望:Lesch-Nyhan综合征因编码次黄嘌呤核糖转移酶(HPRT)的基因缺陷而引起遗传代谢性脑病。若能将携带HPRT基因的Lv注入体内神经元，很可能对此病产生良好疗效。又如用Lv将多药耐药基因导入造血干细胞可使其耐受较大剂量化疗，对治疗白血病及其它恶性肿瘤的疗效有促进作用［16］。

4 AAV

4.1 AAV的结构

AAV是无被膜的线状单链DNA病毒。现已分离出11种血清型AAV［17］。从人体中分离的AAV2研究最透彻，其基因组所含的末端倒转重复序列(inverted terminal repeat，ITR)是复制、整合和包装所必需的顺式作用元件，具有转录启动子活性。基因组中Rep蛋白与位点特异性整合相关。cap基因编码的3种衣壳蛋白与感染性病毒颗粒相关。重组AAV载体即由野生型AAV以目的基因取代病毒编码序列(rep和cap)构建而成。

4.2 AAV的优缺点

AAV系统免疫原性低，能转染分裂期和非分裂期细胞，有整合到特殊位置的潜能。其广泛的趋向性，能完成多种器官的有效转导［18］。然而重组AAV载体的包装容量不足仍是限制其应用的一个主要因素。不过有专家指出解决之道:共表达多基因的几种策略中，合编入核糖体内部进位点是扩容更为有效的策略［19-20］。

4.3 AAV载体的应用

人群中AAV感染率很高但尚未发现该病毒是疾病的致病因素。Gorbatyuk等［21］于P23H基因突变鼠的视网膜下注射携带核酶Rz525的重组AAV2/5载体，12周后检测到视网膜电图a波和b波的振幅。视网膜结构分析也表明基因转移能阻止视网膜外核层的变性。此外，重组AAV也是很有潜力的提高某些骨科疾病疗效的基因转移工具［22］。Larsen等［23］成功应用重组AAV载体转染骨髓基质细胞。Zhang等［2］利用重组AAV携带血管内皮因子和骨形态发生蛋白基因共转染至兔骨髓间充质干细胞获得高表达，并且体内试验证实八周后能促使缺血患肢明显成骨。FDA也证实一系列临床实验表明AAV2在治疗某些人类疾病有效，包括炎症性关节炎、癫痫、血友病B和肌营养不良等［24］。

5 杆状病毒

5.1 杆状病毒的结构

杆状病毒是有囊膜的双链环状DNA病毒，基因组大小为80～180 kb。其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的包涵体内。病毒粒子形态分两种:其一为出芽型病毒粒子，介导细胞与细胞间的感染;其二是包埋型病毒粒子，入侵肠上皮细胞。病毒DNA分子以超螺旋存在于杆状核衣壳中。核衣壳又包括衣壳蛋白和髓核:前者是杆状病毒粒子结构蛋白，后者含病毒DNA和碱性蛋白。

5.2 杆状病毒的改良

杆状病毒可被血清中的补体成分灭活，抑制了其转导效率。很多人正在探索改良之道:通过对其进行伪型杆状病毒修饰，可抵抗补体的灭活作用，或在杆状病毒多角体基因和重组载体上置入loxP位点也能提高转导效率。据λ噬菌体位点特异重组原理［25］，将attR位点置入杆状病毒基因组可获得BaculoDirectTM线性DNA。在含GatewayTMLR ClonaseTM酶的情况下，此基因组与外源基因重组后得到的系统速度快、效率高。

5.3 杆状病毒优点及应用

杆状病毒载体具有多项优势:(1)基因组载量大，可达38 kb。可同时表达多基因，甚至携带整个病毒基因组;(2)安全性高，对细胞无毒。重组杆状病毒在人体细胞内不能复制;(3)真核表达，其产物可行翻译后修饰且能很快获得高表达。

杆状病毒表达载体现已成为基因工程四大表达系统之一［26］。并且很快被用于医学领域:(1)单抗研制。以杆状病毒的颗粒表面病原体为抗原蛋白，得到单克隆抗体。不用纯化抗原就能直接免疫动物;(2)新型疫苗研制。将外源蛋白与杆状病毒的囊膜蛋白融合，可作为疫苗诱导动物产生保护性免疫。Xu等［27］将猪瘟病毒E2糖蛋白与gp64蛋白融合之后用其免疫小鼠，发现能够诱导其产生E2中和性抗体;(3)可作为哺乳动物的基因转移载体。Kim等［28］发现杆状病毒携带端粒逆转录酶能抑制小鼠神经胶质瘤的生长。刘正山等［29］用重组杆状病毒(BacVCMV-EGFP)对小鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs进行转导，发现BacVCMV-EGFP对恒河猴及人的BMSCs转导率明显高于前两者。表明重组杆状病毒可作为灵长类动物BMSCs基因修饰的理想载体。

6 展望

病毒载体的应用促进了很多领域的科研工作及临床治疗，其优势有利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高;复杂的装配过程由细胞完成;不同病毒载体有不同表达特点。其缺点包括病毒应用的安全性(细胞毒性、染色体毒性、免疫毒性等)、基因转移中的靶向性(转导靶向性、转录靶向性等)以及基因转移的有效性(转导效率、基因表达水平、持续时间及表达的可调控性等)等问题。

Rv载体用于体内治疗时仍存在安全性及基因在宿主细胞中的调控等问题。如何提高病毒的感染效力并稳定表达目的基因是今后研究逆转录载体的一大内容;第三代腺病毒载体已广泛用于多种动物实验模型，但临床应用进展较缓。其中AdF35是改进的了腺病毒亚型，因它能感染某些特殊细胞而日益受关注［30］;找出对靶细胞有亲嗜性的重组AAV血清型，设计出组织特异性启动子来提高重组AAV载体的转染率和安全性可为基因治疗带来新希望;重组获得可调控外源基因表达、靶向性强的Lv载体是今后应用的方向;杆状病毒在研制非复制型基因治疗载体及疫苗方面极具应用前景。今后将从提高转染效率和表达水平及减少宿主对杆状病毒的灭活作用等方面增强其在体内存活力和稳定性。随着高效、安全的基因传递体系不断被改良和研发，基因治疗必将得到更广泛的应用。

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