蛋白质结晶方法的研究进展

刘四化，王倩倩，肖 良，张黎明

(第二军医大学 海医系防化医学教研室，上海 200433)

蛋白质结晶方法的研究进展

刘四化，王倩倩，肖 良，张黎明

(第二军医大学 海医系防化医学教研室，上海 200433)

蛋白质结晶是蛋白质分子从过饱和溶液中析出形成晶体的过程，结晶是蛋白质结构生物学研究的基础，也是主要的技术难点。本文总结了常用的蛋白质结晶方法，介绍了近年来蛋白质结晶相关的新技术和新策略。

蛋白质结晶;蒸汽扩散;籽晶技术;多孔材料;化学修饰

蛋白质结晶即蛋白质分子从过饱和的溶液中析出形成晶体。结晶的过程是蛋白质分子相变的过程，分为晶核形成和晶体生长两个阶段。伴随着晶核的形成，溶液中蛋白质的浓度逐渐降低，推动体系向相对稳定的区域转变，该区域晶体长大而晶核数量不再增加［1］。晶核可以由均相成核或非均相成核两种过程形成［2-3］，同时晶体的生长过程首先是处于过饱和临界点的溶液体系中溶质分子聚集在一起，其次是这些溶质分子从无序集群到有序结构的重组过程。大部分蛋白分子的结晶过程都遵循这一规律［4］。

蛋白质结晶是结构生物学研究的主要难点。尽管高通量结构基因组学的出现简化了目标蛋白质的表达、纯化、结晶以及数据的收集过程，但仍然只有少量蛋白质能生成满足衍射要求的单晶［5］，这从侧面反映了获取蛋白质优质单晶的困难程度。迄今为止，除已有大量经验积累外，还没有发现蛋白质的结晶条件与其结构之间有明显的相关性，也没有任何一套实验系统或理论能保证优良蛋白质晶体的产生和生长。本文总结了传统的结晶方法，同时介绍了蛋白质结晶相关的新技术和新策略，相信对蛋白质药物的应用研究会有一定启发。

1 传统结晶方法

1.1 蒸汽扩散结晶法

蒸汽扩散结晶法是最常用的蛋白质结晶方法，它形成的大分子晶体种类远远超过批量结晶和自由界面扩散结晶法［6］形成的大分子晶体种类。通常蒸汽扩散法分悬滴法和坐滴法两种。悬滴法中待结晶液滴悬挂于盖玻片的下方，而坐滴法中蛋白溶液位于样品池溶液上方的底座上。一般悬滴法较常用，但坐滴法可借助显微摄像技术自动监测蛋白质的结晶情况，更适于高通量蛋白质的结晶实验。

1.2 批量结晶法

蒸汽扩散结晶法结晶在方便的同时也存在较多缺陷，比如因液滴体积的改变、离子浓度变化引起的pH值的改变等，温度的轻微变化会导致形成的结晶溶解等。而批量结晶法可将液滴孵育在低密度(0.87 g/cm3)石蜡油中，一段时间内处于相对稳定的体系中，体积和pH等不会改变，形成的晶体也不会被溶解［7］。与蒸汽扩散结晶法相比，批量结晶法操作简单，比较适合于高通量实验［8］，由于批量结晶法相变的数据比较少，筛选结晶条件的效率较低。而经过改进，采用硅胶和石蜡的混合物比单一的石蜡有更高的筛选效率［9］，因而在微量批量结晶实验中有较多的应用。

1.3 透析结晶法

在透析结晶法中，大分子蛋白质和小分子结晶剂之间由半透膜分开，两边存在的浓度梯度使得小分子结晶剂通过半透膜与大分子蛋白质混合，而大分子的蛋白质不能通过半透膜，从而使膜内溶液过饱和并产生蛋白质晶体。该法的优点在于寻找结晶的最佳条件过程中透析袋内的蛋白质可以重复使用。但是，透析结晶限制了诸如聚乙二醇(PEG)等结晶剂的使用，因为PEG吸出透析袋内水分的速度远大于其渗入膜的速度，从而导致袋内蛋白质产生沉淀。

用于蛋白质结晶的常规方法还有很多，如升华结晶、协同沉淀法结晶、凝胶扩散结晶、水热法及溶剂热法结晶、膜结晶等。随着交叉学科的迅猛发展，越来越多的物理方法被应用于这一研究领域，王弘等［10］对于常规的蛋白质大分子结晶方法以及结晶的影响因素作了较详细的总结。

2 新技术的应用

2.1 籽晶技术

籽晶技术是指将劣质的晶体植入与其结晶条件相似但不完全相同的新的体系中。籽晶技术最早应用于结晶条件的优化实验，通过直接在亚稳区加入已经形核的籽晶(或晶核)，可保证有限的晶核生长成大的单晶［11］。D'Arcy等［12］开发了一种简单、全自动的微晶技术，用导入籽晶的方法对牛胰岛素等5种蛋白结晶条件进行了筛选，发现导入籽晶可以使蛋白质结晶筛选的成功率提高2.5～65倍。进一步研究发现［13］，有时候晶种的引入是通过改变结晶母液的化学位移引起晶体的生长，而不是晶种本身引发晶体的生长;某些条件下通过引晶能产生小而多的晶体。这些结果表明，某些情况下向母液中植入晶种能诱导晶体生长而其他条件下晶种可能不引发晶体生长。因此，通过改变化学位移而引起的晶体生长扩大了选中结晶条件的概率。

2.2 用配体稳定蛋白质

用配体稳定蛋白质不仅能使蛋白质活性更加稳定和更容易结晶，而且能提高获得高质量单晶的机会。例如，在200个已被结构基因协会确定的蛋白质中，100个结合配体才能结晶，约有20个结合配体后才能进行结构测定［14］。相信在不久的将来，不管小型实验还是结构基因组学等大规模实验中，用小分子化合物来稳定功能蛋白将会越来越普遍。

氨基酸及氨基酸衍生物是其他一类影响蛋白质分子热稳定性和折叠性的化合物［15］。Ito等［16］验证了一些氨基酸(如赖氨酸)和氨基酸衍生物(如甘氨酸乙酯和甘氨酸酰胺)对马血红蛋白和牛胰核糖核酸酶A结晶的影响。向蛋白溶液中添加氨基酸及氨基酸衍生物可以扩大筛选结晶条件的范围，这样能获得高质量的单晶。如DNA解旋酶——DnaB，它在4℃的纯化缓冲液中活性仅能保持几分钟，但经过优化后可以在60℃稳定数小时［17］。

2.3 人工诱导成核

有人认为，蛋白质晶体大多数是均质生长的。事实上，由于受到微观杂质和不溶聚合体的影响，它们都是核异质的［2］。可以肯定，精确控制晶核的数量和晶核生长的过饱和点有助于形成高质量的晶体［18］。诱导非均相成核的方法有很多种，其中包括多孔硅胶在内的多孔材料的使用。多孔材料表面含有大量的形状和大小不同的微孔，给定的大分子能找到形状和大小匹配的成核孔［19］，这些孔腔是用来“欺骗”蛋白分子，从而促使晶核形成和晶体生长。目前使用较多的多孔材料是一种无定形多孔生物活性玻璃(CaO-P2O5-SiO2)［3，19］，它以直径约为 100 μm 的颗粒植入待结晶液滴中。多孔生物玻璃促进成核不需要附加条件，也不受分子质量、pH值和沉淀剂的影响［19］。此外，纤维素、羟基磷灰石粉末以及带孔的一些天然物质也成功诱导成核［20］。

2.4 蛋白质修饰

分子生物学方法中，通过取代特殊氨基酸残基、修饰特定的侧链或者合并翻译后修饰等方式来赋予蛋白质结晶特性。常用的提高蛋白质结晶特性的化学修饰方法是赖氨酸残基甲基化的还原［21］，这种方法通过提高甲基化的赖氨酸侧链的疏水性来降低蛋白质的溶解度。研究表明，有40%的蛋白质在甲基化还原后重新获得结晶能力［22］。

替代半胱氨酸残基或还原羧甲基半胱氨酸残基也是常用的化学修饰法［23］。半胱氨酸残基的替换在不影响蛋白功能的前提下，能使更多的蛋白质适合结晶。与赖氨酸修饰相反，羧甲基半胱氨酸残基的还原能增加蛋白质的溶解度，从而防止蛋白的聚合和展开［24］。例如以丙氨酸替代大肠杆菌蛋白RecX(DNA同源重组的调节蛋白)中113位和118位半胱氨酸，能够使RecX结晶［25］。另一个策略是在暴露于溶剂中的蛋白质表面引入半胱氨酸残基，通过二硫键形成人工二聚体，这种二聚体呈现对称性，对称的蛋白质分子更容易结晶［26］。通过这种方法形成人工二聚体噬菌体T4溶菌酶，比传统的气相扩散方法能多获得6个新的单晶。人工半胱氨酸二聚体法似乎比较适合于小型蛋白质的结晶［26］。

此外，原位水解也用来修饰蛋白质，它的应用能成倍增加蛋白质结晶和结构测定的成功率［27］。据报道，270种以上可溶性蛋白质经过原位水解，获得符合结构测定要求晶体的概率增加了约12%［28］。

2.5 生物物理技术的应用

大量的生物物理技术和方法被用来评价蛋白质溶液的稳定性。常用的两种技术是发射荧光光谱和光散射技术，它们帮助确定能辅助筛选蛋白质结晶的稳定条件［29］。前者通过测量荧光的变化来监测蛋白质的展开或因配体结合引起的构象变化，而动态光散射可用来测定一个样本是否适合结晶［30］。此外，动态光散射技术利用光学显微镜可以监测由于温度、pH值、离子强度或添加物引起的蛋白质聚集［31］并转变为晶核的过程，帮助实验者锁定溶液从成核条件到晶体生长条件转变的时间点，在高通量模式的应用中，动态光散射技术已经趋向于小型化和自动化［32］。此外，以荧光为基础的热转移测定技术［33］则在筛选蛋白质的结晶条件如pH值、添加剂以及缓冲液等方面具有明显的优越性。这些新技术帮助研究者寻找蛋白质的结晶规律，摸索结晶条件，并最终得到高质量单晶。

3 展望

尽管近几年结构生物学的研究飞速发展，但蛋白质结晶很大程度上依然是经验科学。在蛋白质可结晶性的研究中，多数的研究只是针对几种常用的蛋白质进行，所以当用这些技术筛选其它蛋白质结晶条件时，缺乏普遍的适用性。因此，应进一步深入认识蛋白质的结晶规律，结合先进的科学技术，采用更多的结晶策略和方法使目标蛋白更容易结晶。

蛋白质的三维结构在针对靶标蛋白质的小分子药物研究中起到了非常重要的作用。蛋白质结晶可以快速解决蛋白质-配体或先导化合物复合物的晶体结构，帮助人们理解小分子如何与蛋白质结合，并利用其相关结构信息设计新的药物分子［34］。蛋白质结晶技术的发展加速了蛋白质药物的应用研究，利用现代生物技术对生物体分离纯化所得的氨基酸类，肽类和蛋白类物质进行结晶后的结构分析，积极的促进了蛋白质药物的开发研究。

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Progress in techniques on protein crystallization

LIU Si-hua，WANG Qian-qian，XIAO Liang，ZHANG Li-ming
(Department of Chemical Defense Medicine，Faculty of Naval Medicine，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

TQ464.7

A

1005-1678(2011)05-0405-03

2010-07-16

上海市自然科学基金(10ZR1437900)

刘四化，男，硕士研究生，主要从事海洋生物毒素蛋白分离纯化研究;张黎明，通信作者，教授，博士生导师，E-mail:lmzhang1969@yahoo.com.cn。