纤维素酶和乳酸菌混合制备槐树叶青贮饲料的工艺

王巍杰 尹丹 王丽萍

随着饲料工业的快速发展，自然资源日渐短缺，人畜争粮矛盾更加严重，亟待开发新的饲料资源。植物树叶含有丰富的蛋白质、维生素和多种矿质营养物质[1]，能够满足动物日常养分的需要。但由于树叶中纤维素含量高，严重影响动物的消化率和适口性，文中以槐树叶为原料，研究纤维素酶和乳酸菌混合制备青贮饲料的工艺过程。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

粉碎烘干的新鲜槐树叶；复合乳酸菌制剂（乳酸菌、双歧杆菌、粪肠球菌）由厦门六维生物制剂公司提供；纤维素酶（活性800 U/ml）由河南郑州雅大生物工程股份有限公司提供；硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、3，5-二硝基水杨酸、葡萄糖均为分析纯。

HS-3C型酸度计（上海佑科仪器仪表有限公司生产）；DKB-501A型超级恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司生产）；752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司生产）；FA1004型电子天平（上海越平科学仪器有限公司生产）。

1.2 方法

1.2.1 槐树叶青贮饲料的制备

准确称取100.00 g的槐树叶于广口玻璃瓶中，加入适宜比例的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液调整适当的含水量，高压灭菌，添加适量纤维素酶，恒温水浴一段时间后，测还原糖，计算糖化率；再混合适量乳酸菌，在适当温度下发酵一定时间,60℃干燥后，即得槐树叶青贮饲料。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 糖化率[2]

糖化率（%）=（还原糖×0.9/槐树叶中纤维素含量）×100。

还原糖含量[3]用葡萄糖标准曲线y=0.527 7x-0.049 7（r=0.999 8，n＝6，由752型紫外-可见分光光度计绘制）计算。

1.2.2.2 pH值[4]

取槐树叶青贮饲料样品10.00 g于烧杯中，加入100 ml蒸馏水，均匀搅拌，4℃静置24 h，用酸度计测定青贮饲料浸出液pH值。

1.2.2.3 营养成分含量

粗蛋白含量的测定采用凯式定氮法[3]并且参照GB/T6432—94[5]；粗纤维含量的测定采用酸性洗涤剂法[3]；水溶性碳水化合物（wsc）含量的测定采用硫酸—蒽茼比色法[3]。

2 结果与分析

2.1 影响纤维素酶降解槐树叶的因素

2.1.1 pH值对纤维素酶降解的影响(见图1)

图1 pH值对纤维素酶降解的影响

按1.2.1操作，分别考察在pH值3.6、4.0、4.4、5.0和5.6的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液中，加入相同的纤维素酶恒温水浴后糖化率的变化，试验结果见图1。结果显示：在pH值3.6～4.4的范围内，随着pH值的增加，还原糖的糖化率逐渐升高，当pH值大于4.4时，糖化率随着pH值的增加逐渐减小，初步确定正交实验的pH值4.4、4.6和5.0。

2.1.2 温度对纤维素酶降解的影响(见图2)

图2 温度对纤维素酶降解的影响

按1.2.1操作，在pH值为4.4的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液中加入相同的纤维素酶，在温度35、40、45、50和55℃条件下，恒温水浴相同时间后，分别测定还原糖的糖化率。实验结果如图2所示：在温度35～50℃范围内，还原糖的糖化率随温度的升高而增大，温度大于50℃时，糖化率呈现下降趋势，综合考虑纤维素酶的最适反应温度，确定正交实验的反应温度为45、50和55℃。

2.1.3 酶解时间对纤维素酶降解的影响(见图3)

图3 酶解时间对纤维素酶降解的影响

按1.2.1操作，在pH值为4.4的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液中加入相同的纤维素酶，在水浴温度50℃，反应时间12、16、20、24、28、32、36、40、44和48 h条件下测定糖化率的变化，实验结果表明：随酶解时间的增加，糖化率呈逐渐上升趋势，但随时间的延长，糖化率增长速度缓慢，可能由于在酶解过程中产生了对纤维素酶有抑制作用的产物，减慢了酶水解的速率[6]。因此，确定正交实验的酶解时间为40、44、48 h。

2.2 纤维素酶降解槐树叶最佳工艺条件的确定

以还原糖的糖化率为考察指标，按1.2.1纤维素酶降解槐树叶操作，设计L9（34）正交实验，考察pH值、温度、加酶量（由单因素水平实验确定的纤维素酶占槐树叶的质量比）和酶解时间对实验结果的影响，因素水平见表1，实验结果见表2。

表1 纤维素酶酶解正交实验的因素和水平

表2 纤维素酶降解槐树叶的正交实验结果

表2正交实验结果显示：pH值、温度、加酶量和时间对酶解糖化率的影响顺序为B＞A＞D＞C,最佳组合为A1B2C1D3，确定纤维素酶降解槐树叶最佳工艺条件：pH值4.4、温度50℃、加酶量0.75%和酶解时间为48 h。

2.3 乳酸菌发酵最佳工艺条件的确定

以2.2确定的纤维素酶解的最佳工艺条件按1.2.1进行操作，用加入柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液的量控制槐树叶含水量，设计L9（34）正交实验，以制得的槐树叶青贮饲料粗蛋白为指标，考察含水量、温度、乳酸菌添加量（槐树叶质量比）对实验结果的影响，因素水平见表3，实验结果见表4。

表4正交实验结果显示：含水量、温度和乳酸菌添加量对乳酸菌发酵槐树叶的影响主次顺序为A＞B＞D,最佳组合为A2B1D2，确定乳酸菌发酵的最佳工艺条件为含水量70%、温度35℃和乳酸菌添加量为1.5%。

表3 乳酸菌发酵槐树叶正交实验的因素和水平

表4 乳酸菌发酵槐树叶的正交实验

2.4 槐树叶青贮饲料营养指标

在最佳工艺条件下制备槐树叶青贮饲料，感官评定[4]：颜色呈深绿色，无霉变，有草香味。测得粗蛋白含量23.54%、粗纤维含量9.18%、碳水化合物含量为3.31%,pH值为4.57。

3 结论

在树叶饲料制备过程中添加纤维素酶可降低纤维素含量，还能促进可溶性糖的转化，有利于乳酸菌发酵，改善饲料口味。通过正交实验分别确定了纤维素酶酶解和乳酸菌发酵制备槐树叶青贮饲料的工艺条件：在pH值4.4、温度50℃、加酶量0.75%和酶解时间48 h条件下纤维素酶酶解效果最好；乳酸菌发酵槐树叶制备青贮饲料的条件为含水量70%、温度35℃和乳酸菌添加量1.5%。

[1] 赵林,李国军，唐莹，等.利用银杏叶制备酵母饲料添加剂的优良菌筛选及其培养条件[J].林产化学与工业，2007,27（3）：37.

[2] 刘小杰,郭秀峰,欧凯.利用纤维素酶降解稻草粉[J].中国食品添加剂，2009（4）：99-102.

[3] 常丽新,田秀红,闫峰,等.食品分析技术[M].北京:中国科学技术出版社,2004.

[4] 王鹏,刘丹丽,高仲元,等.含水量和乳酸菌制剂对狗尾草发酵品质的影响[J].草地学报，2006，14（3）：269-273.

[5] 马东霞.GB/T 6432-94—1994饲料中粗蛋白测定方法[S].北京：中国标准出版社，1995:70-73.

[6] 崔立,刘忠.酶水解纤维素条件的优化[J].天津科技大学学报，2010（2）：41-44.