诱导多能干细胞相关载体的研究进展

曾岳岳， 黄正接， 罗 琪

2006年日本京都大学的Takahashi等［1］首次报道，将选择的特定外源性转录因子导入小鼠的成纤维细胞，可以成功诱导出多能性的类胚胎干细胞，他们把这类细胞命名为——诱导多能干细胞(iPS cell)。这一新的突破在理论上首次证实了已分化成熟的体细胞同样可以被重编程而转化为类胚胎干细胞，且成功地解决了难以突破的伦理及免疫排斥问题，为再生医学增加了一个新途径。运用此重编程技术能从特定疾病的患者体内提取成体细胞，进而诱导成疾病特异iPS细胞。疾病特异iPS细胞的诱导成功更为体外研究遗传疾病发生、发展和组织形成提供了更加广泛和大量的研究模型，并将有力推动基因治疗和药物研发。但是，重编程外源基因组及使用病毒载体会影响iPS细胞基因组，即可能引发潜在的插入性肿瘤和干扰诱导多能干细胞分化。因此，寻找合适的载体是诱导多能干细胞技术的重要研究课题。载体是由质粒、噬菌体及病毒衍生而来的，具有携带功能的DNA分子，在载体中可插入外源基因片断，通过转化、转染或利用病毒进入细胞的机制导入到一个宿主细胞中，并在其中进行复制或表达。

1 使用病毒载体诱导iPS细胞

1.1 以逆转录病毒和慢病毒为载体 2007年Okita 等［2］报道，以逆转录病毒为载体，将 Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种因子导入人类成纤维细胞，成功诱导成类胚胎干细胞。几乎与之同时，美国科学家Yu等［3］也成功地将人类成纤维细胞诱导成类胚胎干细胞。与Okita研究组所不同的是，Yu等运用的载体为慢病毒，所采用的转录因子是通过自筛而确定的4种因子组合，即 Oct3/4、Sox2、Nanog和 Lin28。结果显示，生成的iPS细胞与人的类胚胎干细胞特性高度一致。随后，研究小组将iPS细胞注入先天免疫缺陷的裸鼠皮下，得到包含三胚层细胞的畸胎瘤，进一步证实其具有类似胚胎干细胞的发育潜能。使用逆转录病毒或慢病毒作为载体转染体细胞诱导成iPS细胞的方法，因其直接使外源性基因和载体整合到受体体内的基因组，会引起插入突变以干扰正常的iPS细胞系的功能，而细胞中残余的外源因子序列的表达会影响分化，甚至有导致肿瘤发生的危险性。特别是原癌基因c-Myc的导入，由其构建的嵌合体小鼠中约20%发生了肿瘤［3］。因此，目前很多学者已采用其他方法替代原癌基因c-Myc的转导，而以逆转录病毒和慢病毒为载体诱导iPS细胞的临床应用也受到了极大的限制。

1.2 以腺病毒为载体 2008年 Stadtfeld等［4］报道，使用腺病毒载体(adenoviral vectors)转染Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种因子，成功地将小鼠肝细胞改造成iPS细胞。研究者使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和 Southern blotting等方法未发现腺病毒载体基因组及转导因子基因组整合到宿主细胞基因组中的迹象。与逆转录病毒、慢病毒相比，腺病毒载体可以使外源基因组不会整合到宿主细胞基因组当中，解决了外源基因组对iPS细胞分化干扰的难题。然而，以腺病毒为载体诱导iPS 细胞的效率非常低(0.000 1% ～0.001 8%)，比逆转录病毒为载体的诱导率(0.1%)低很多，这就限制了其临床应用。

2 使用质粒载体诱导iPS细胞

2.1 以质粒为载体 2008年日本学者Okita等［5］使用质粒(plasmid)为载体，携带转染所需的因子基因，成功地将小鼠成纤维细胞诱导成类胚胎干细胞——iPS细胞。这种方法不仅防止了病毒载体基因组整合到宿主细胞基因组中，同时可以防止外源基因干扰iPS细胞的分化。Okita等利用质粒的自我复制和转录等特性，设计了两种携带转染因子的质粒改造小鼠成纤维细胞，一种为pCX-OKS-2A，其由一段2A肽(来自口蹄疫病毒，具有自我清除作用)携带Oct4、Sox2和Klf4 3种转导基因;另一种是pCX-c-Myc，由一段2A肽携带c-Myc转染基因。两种质粒经多次瞬间转染，将小鼠成纤维细胞诱导成iPS细胞。此法大大消除了插入性肿瘤形成的风险及再激活癌基因的可能性。但其仍然无法突破一个障碍——iPS细胞诱导率极低。采用此法转导1×106个成体细胞只成功改造了1～29个iPS细胞，而在同样的实验条件下，采用逆转录病毒作为载体却能成功转染1～1 000个iPS细胞［6］。西班牙学者Gonzalez等［7］改进了Okita研究组的方法，他们采用一个质粒载体就将小鼠胚胎成纤维细胞成功地诱导出iPS细胞。并设计出一个含Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4种转导基因的多顺反子质粒载体pCAG-OSKM，通过瞬间转染的方法改造小鼠胚胎成纤维细胞成iPS细胞。但诱导率仍很低。

2.2 以oriP/EBNA1质粒为载体 Yu等［8］于2009年利用oriP/EBNA1质粒，首次生成无外源基因重编程的人iPS细胞。EBNA1和oriP是EB病毒(epstein-barr virus，EBV)中与复制和保持病毒基因组游离性的重要基因元件。具有oriP/EBNA1的质粒转染人靶细胞后不整合，并可长期稳定存在，不会造成宿主细胞的突变。同时，由于其具有增强转录及免疫逃逸等功能，使质粒携带的目的基因能够获得较高的转染效率［9］。Yu工作小组经研究得出，当oriP/EBNA1质粒只整合 Oct4、Sox2、Nanog及 Lin28 4种外源基因，其改造人新生儿包皮成纤维细胞的成功率为0.1%，但当再增加c-Myc和Klf4转导基因后，其诱导成功率则增加10倍。

3 使用酶切系统诱导iPS细胞

3.1 利用 Cre/LoxP重组系统 Soldner等［10］从帕金森病患者身上提取成纤维细胞和利用强力霉素诱导的慢病毒载体，通过酶切Cre/LoxP重组系统成功地培育出不含外源基因的人iPS细胞。酶切Cre/LoxP系统可以使某一基因在特定的组织、细胞中，在细胞分化，成熟过程的某一时段被剔除，以减轻其带来的副作用。这虽能除去外源因子序列，但载体序列仍会有残留，因此仍可能造成插入性突变。此外采用这种方法诱导的成功率仍然很低，转染Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4种基因后，其诱导成功率只有0.01%［11］。

3.2 利用piggyBac转座子 Yusa等［12］报道，利用piggyBac转座子方法，将小鼠胚胎成纤维细胞成功地改造成iPS细胞。piggyBac是一种从粉纹夜蛾(trichoplusia ni.)中分离到的、具有TTAA插入位点特异性的DNA转座子。piggyBac可在昆虫基因组中准确切离，转化频率较高，且不受宿主因子的限制［13］。Yusa研究小组设计了含有piggyBac转座子系统、具有自我清除作用的F2A肽及T2A肽的载体，转染 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc基因。此载体能通过piggyBac转座子系统形成的转座酶及F2A肽和T2A肽切除插入的外源基因和载体序列，因此，得到的iPS细胞不会留下外源基因组的“足迹”［14］，可更好地应用于临床。更重要的是利用piggyBac转座子转染 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和 Lin28 5 种基因能使转导率达到1%，相当于以逆转录病毒为载体的转导率［15］。

4 使用重组蛋白诱导iPS细胞

2009年 Zhou 等［16］将重组蛋白(Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和c-Myc-11R)转入小鼠胚胎成纤维细胞，成功地诱导出类胚胎干细胞——蛋白诱导多能干细胞(piPSC)。这一技术在诱导iPS细胞领域里产生了重大的突破，能在不涉及基因组调节的情况下，只凭借蛋白质就能将小鼠胚胎成纤维细胞诱导成iPS细胞，这一技术大大简化了将细胞重编程为类胚胎干细胞的常用技术的繁琐步骤。Zhou的研究小组首先将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4种基因重编程大肠杆菌细胞，促使大肠杆菌表达4种基因，形成的蛋白经过正确折叠、修饰、纯化和连接目标肽，在目标肽的引导下通过渗透法进入小鼠胚胎成纤维细胞，发挥诱导功能。实验证实只有通过反复多次的转入重组蛋白，才可能诱导出类胚胎干细胞。这种方法与之前诱导多功能干细胞的方法相比有以下2点优势［17］:(1)有效地消除了外源基因和序列对细胞基因的修改造成的风险;(2)蛋白转导的方法更加简单快速、经济实用。然而，缺点就是难以提高转导效率，在转导4种重组蛋白及组蛋白脱乙酰化酶抑制剂——丙戊酸(valproic acid，VPA)(也能提高Oct4、Sox2、和Klf4 3种基因诱导的成纤维细胞重编程效率［18］)的作用下，仅能将5×104个小鼠胚胎成纤维细胞成功改造得到3个iPS细胞。

5 结语

iPS细胞研究在短短几年时间里已取得重大的突破，为避免重编程外源基因可能导致受体发生插入性肿瘤及影响细胞分化等潜在性危险，应尽量减少外源基因的整合。从2006年 Takahashi等转导Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc等24种因子到如今 Kim等［19］只转导Oct4一个基因就诱导得到iPS细胞，可见其研究进展是迅速的。科学家首次诱导iPS细胞使用了逆转录病毒，出现了载体的序列整合到宿主细胞基因组，存在癌基因激活的危险。因此，研究者又陆续研发了慢病毒、腺病毒、质粒载体，重组蛋白转染成体细胞诱导得到iPS细胞，大大减少了外源基因的整合，然而科学家在设计出更安全的载体后，又普遍出现了诱导效率低下的困惑，这严重影响了诱导多能干细胞的临床应用及药物开发。因此，iPS细胞领域的研究者都期待着在不转导外来基因组的情况下，通过蛋白转导或寻找更适合的诱导细胞和载体技术，创造出更安全、更高效、更稳定的 iPS细胞。

［1］Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126(4):663-676.

［2］Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S.Generation of germline-competentinduced pluripotent stem cells［J］.Nature，2007，448(7151):313-317.

［3］Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］.Science，2007，318(5858):1917-1920.

［4］Stadtfeld M，Nagaya M，Utikal J，et al.Induced pluripotent stem cells generated without viral inte gration ［J］.Science，2008，322(5903):945-949.

［5］Okita K，Nakagawa M，Hyenjong H，et al.Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors［J］.Science，2008，322(5903):949-953.

［6］Hasegawa K，Cowan AB，Nakatsuji N，et al.Efficient multicistronic expression of a transgene in human embryonic stem cells［J］.Stem Cells，2007，25(7):1707-1712.

［7］Gonzalez F，Barragan Monasterio M，Tiscornia G，et al.Generation of mouse-induced pluripotent stem cells by transient expression of a single nonviral polycistronic vector［J］.PNAS，2009，106(22):8918-8922.

［8］Yu J，Hu K，Smuga-Otto K，et al.Human induced pluripotent stem cell free of vector and transgene sequences［J］.Science，2009，324(5928):797-801.

［9］何婕，张智清.基于EBNA1和oriP的载体在基因治疗中的应用研究进展［J］.生物工程学报，2005，21(3):507-510.

［10］Soldner F，Hockemeyer D，Beard C，et al.Parkinson＇s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factor［J］.Cell，2009，136(5):964-977.

［11］Szabo E，Sobolofr J，Dziak E，et a1.Tamoxifen-inducible cremediated calreticulin excision to study mouse embryonic stem cell differentiation［J］.Stem Cells Dev，2009，18(1):187-193.

［12］Yusa K，Rad R，Takeda J，et al.Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon［J］.Nat Methods，2009，6(5):363-369.

［13］王建军，王常春.piggyBac转座子及其在转基因昆虫中的应用［J］.昆虫知识，2009，46(5):665-669.

［14］Fraser MJ，Ciszczon T，Elick T，et al.Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac(IFP2)and tagalong(TFP3)from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera［J］.Insect Mol Biol，1996，5(2):141-151.

［15］Yamanaka S.Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells［J］.Cell Stem Cell，2007，1(1):39-49.

［16］Zhou H，Wu S，Joo JY，et al.Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins［J］.Cell Stem Cell，2009，4(5):381-384.

［17］Michiue H，Tomizawa K，Wei FY，et al.The NH2 terminus of influenza virus hemagglutinin-2 subunit peptides enhances the antitumor potency of polyarginine-mediated p53 protein transduction［J］.J Biol Chem，2005，280(9):8285-8289.

［18］Huangfu D，Osafune K，Maehr R，et al.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2［J］.Nat Biotechnol，2008，26(11):1269-1275.

［19］Kim JB，Sebastiano V，Wu G，et al.Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells［J］.Cell，2009，136(3):411-419.