城市污水培养富油蛋白小球藻的研究

王海英，牟晓庆

(中南民族大学微生物与生物转化重点实验室，武汉430074)

大量的研究表明，藻类对生活污水、食品加工污水、畜禽场污水、工农业混合污水以及工业污水中的氮、磷等营养物的去除作用和效果均十分显著.利用污水培养微藻能有效地去除造成水体富营养化和其它污染的营养物质，并且处理污水具有成本低、能耗少、效率高、收益大等特点［1，2］，是一项非常有潜力的生态环保技术.

藻类因其光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物产量高的特点而成为国内外公认的生产生物质能源的理想原料［3］.但此类原料的大规模生产系统存在几个技术难题:1)维持微藻种类的稳定相当困难;2)微藻生物质生产力过低;3)微藻生物质生产成本仍显著高于产业化可接受水平［4］.

将微藻生产油脂与处理城市污水相结合，可以创造额外经济效益和生态效益，以此弥补微藻生产油脂成本过高的不足，从而提供显著的环境效益并提高生物燃料技术的经济可行性，可以发展出可再生能源生产和减排的双效模式.

本文对城市污水进行高压和紫外2种方式灭菌后培养了一株油脂含量较高的蛋白核小球藻，评价该藻对污水的净化效果，测定其生物量和油脂产量，对城市污水培养蛋白核小球藻生产油脂的可能性进行初试探索，建立起以微藻处理城市污水为基础的可再生能源新技术路线.

1 材料与方法

1.1 微藻和培养基

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidsa)来自中南民族大学发酵实验室，城市污水取自中南民族大学南湖排污口.藻种的活化及通气扩大培养活化采用SE 培养基(g/L):NaNO30.25、K2HPO4·3H2O 0.075、MgSO4·7H2O 0.075、CaCl2·2H2O 0.025、KH2PO40.175、NaCl 0.025、FeCl3·6H2O 0.005;Fe-EDTA 1 mL、A5;微量元素液1 mL、土壤提取液1 mL.微量元素混合物配方(g/L):H3BO32.86、MnCl2·4H2O 1.81、ZnSO4·7H2O 0.222、Na2MoO4·2H2O 0.39、CuSO4·5H2O 0.079、Co(NO3)2·6H2O 0.0494，40 mL/L的土壤水提上清液.城市污水取自中南民族大学南湖排污口，培养时在污水中加入1.0 mL/L微量元素混合物作为微藻培养基.

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白核小球藻的培养

污水培养基的灭菌分为高压灭菌和紫外灭菌.其中高压灭菌:120℃灭菌20 min;紫外灭菌:距离灯管10 cm照射20 min.在25℃，光照强度约为3500 lux通空气培养，于3 L的三角瓶中培养，装城市污水培养基2.5 L/瓶，无菌空气由空气泵通过硅胶管连接的空气过滤器引入，流速300 mL/min，藻种接种量为培养基的10%，培养温度为28±2(℃)，光照强度为4500 lux，连续光照.

1.2.2 检测方法

藻干重的测定:采用离心法收集藻细胞，培养中止后，经4000 r/min离心10min，用蒸馏水洗涤藻细胞，重复离心，将收获的湿藻细胞干燥，获得藻粉称重.藻油脂含量的测定采用氯仿甲醇抽提油脂［5］.污水中氨氮、总氮、总磷的测定水相同于污水检测中所述方法分析［6］.污水中氨氮、总氮、总磷去除率的计算:去除率=(原始含量－残留量)/原始含量×100%.

小球藻脂肪酸成分及含量的测定［7］:取30 mg冻干藻粉，放入带螺帽的水解管内，加2 mL CHCl3-CH3OH混合液(体积比为2∶1)，充N21 min后密闭封口，超声萃取3 min(33 kHz，300 W)，移出上层清液，重复3次，合并萃取液，移入具塞试管，N2浓缩吹干，加入0.3mL正十七酸内标液(0.4 g/L)，N2浓缩吹干.加1 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，充氮密封，迅速混匀，于70℃水浴中皂化15 min，冷却至室温后加入三氟化硼1 mL，充氮密封，振荡1 min，于70℃水浴甲酯化30 min，冷却至室温，准确加入正己烷2.0 mL，振荡再加入2.0 mL饱和NaCl溶液，振荡，静置，将上层清液取出，准备进样.所有操作须在低光照和氮气保护下进行.使用Agilent6890N气相色谱仪，毛细管色谱柱HP-5(30 m ×320 μm ×0.25μm，5%PhenylSiloxane)进行分析.进样口温度为250℃，氢火焰离子化检测器(FID)温度为300℃，载气为高纯N2，恒流控制，N2流量1.0 mL/min，分流比为30∶1;空气流量400 mL/min，H2流量 30 mL/min;进样量 3 μL.柱温程序升温:第1段柱温为150℃，升温速率为10℃/min，至210℃;第2段柱温为210℃，升温速率为2℃/min，于250℃恒温10 min.以面积归一化法得到各脂肪酸组分的相对百分含量.

2 结果与分析

2.1 小球藻的生长曲线

以光密度表征藻的生长情况见图1.由图1知，第3天～第8天小球藻生长最为迅速.本实验在对培养基灭菌时采用高压灭菌和紫外灭菌，2种灭菌方式下藻生长情况相似，蛋白核小球藻对污水的适应能力很强，在污水中生长良好.

图1 城市污水培养中蛋白核小球藻的生长曲线Fig.1 Growth curve of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

2.2 蛋白核小球藻对污水中COD的净化

图2为蛋白核小球藻对污水中COD的去除曲线.由图2可知，取自南湖排污口污水的初始COD浓度229.74 mg/L，蛋白核小球藻对污水的COD有较高的净化能力.培养过程中2种灭菌方式对COD的降解差别很大.在第3天，紫外灭菌处理培养的藻的COD去除率已经达到51.34%，而高压灭菌处理的COD去除率仅为4.44%;在第6天，高压灭菌处理的COD去除率达到40.92%，而紫外灭菌处理的COD则为60.91%，培养结束时高压灭菌和紫外灭菌的COD去除率分别为65.57%和67.07%，最终的净化效果相同.

图2 城市污水培养中蛋白核小球藻COD的变化Fig.2 Changes of COD in cultivation of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

图3为蛋白核小球藻对污水的脱氮曲线，表明其脱氮能力强，培养完毕脱氮率达到95%以上.其中，第3天去除率仅17.18%，而第4～6天去除率则迅速下降，第6天去除率均超过85%，相对于紫外灭菌，高压灭菌的藻在纯培养条件下总氮浓度下降更快.

图3 城市污水培养中蛋白核小球藻总氮的变化Fig.3 Changes of TN in cultivation of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

图4为蛋白核小球藻对污水中磷的去除曲线.由图4可见，用小球藻处理初始磷浓度为4.30 mg/L的污水时，处理后的磷浓度低于0.39 mg/L，高压灭菌和紫外灭菌方式下的去除率分别达到92.85%和88.34%，且污水中总磷浓度主要在第1～3天呈明显下降.培养至第3天时，高压灭菌处理下污水中总磷残留量为1.38 mg/L，紫外灭菌处理的为2.3 mg/L.说明小球藻能有效去除污水中的磷含量.

图4 城市污水培养中蛋白核小球藻总磷的变化Fig.4 Changes of TP in cultivation of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

图5为蛋白核小球藻对污水中氨氮的去除曲线.小球藻对污水中氨氮的净化效果十分明显，在紫外灭菌和高压灭菌后培养，污水中氨氮去除率分别达到96.71%和97.88%.当藻处于生长适应期时，污水中氨氮去除率已分别达到93.09%和96.35%;当藻生长至第6天，污水中氨氮净化效率达到最高.高压灭菌下的第3～5天，污水中氨氮浓度的下降速率，较紫外灭菌处理的要快.由此可知，小球藻对污水中营养物质氨氮去除效率很高.

图5 城市污水培养中蛋白核小球藻氨氮的变化Fig.5 Changes of NH3-N in cultivation of Chlorella pyrenoidsa with urban sewage

2.3 蛋白核小球藻的生物量及油脂含量

图6为2种灭菌方式下的蛋白核小球藻的生物量和油脂含量.由图6可见，高压灭菌的藻的纯培养有利于生物量的富集，培养的藻生物量较紫外灭菌方式后培养的藻生物量高出43%，2种灭菌方式对油脂含量的影响不大，分别为 15.11%和17.86%.

图6 城市污水培养蛋白核小球藻的生物量及油脂含量Fig.6 Biomass and lipid content of Chlorella pyrenoidsa cultivatingwith urban sewage

2.4 蛋白核小球藻脂肪酸含量

不同灭菌方式对蛋白核小球藻脂肪酸组成的影响见表1.由表1可知，C.pronoidosaNo.2的脂肪酸组成比较简单，均为十六碳脂肪酸和十八碳脂肪酸，主要的脂肪酸组成有7种，其中饱和脂肪酸为16∶0(棕榈酸)、18∶0(硬脂酸)，不饱和脂肪酸16∶1(棕榈油酸)、16∶2、18∶1(油酸)、18∶2(亚油酸)、18∶3(亚麻酸).实验表明C.pronoidosaNO.2主要为18∶1和16∶2脂肪酸，其百分含量分别为12.57%和28.94%，而16∶0和18∶3脂肪酸所占比例较小，其中紫外灭菌培养基的藻中18∶3脂肪酸百分含量较高，而高压灭菌的培养基18∶2脂肪酸百分含量较高.单不饱和脂肪酸的量为23.22%，有利于安全储存、运输，以及在常温保持液体状态.

表1 灭菌方式对蛋白核小球藻脂肪酸组成的影响Tab.1 Fatty acids compositions of C.pronoidosa with different sterilization method

3 结语

实验结果表明，蛋白核小球藻在城市污水水中生长良好，在生长过程中利用污水中的磷、氮等有机物质，作为自身生长的营养元素，培养后的污水中总磷含量为0.39 mg/L，总氮含量为2.37 mg/L，已达到农田灌溉和工业生产的标准，同时对有机质的降解效果也较为理想，可有效地去除COD.紫外灭菌和高压灭菌2种方式对污水中氨氮、总磷、总氮的去除率接近，小球藻可快速有效去除氨氮，说明蛋白核小球藻可通过光合作用吸收污水中的氨氮作为营养物质迅速生长;小球藻对于总氮、总磷的去除贯穿整个吸附过程，且去除率无氨氮高，说明小球藻对部分氮、磷的吸附属于缓慢吸附.由COD的变化趋势可知，紫外灭菌条件下，COD于第1～3天迅速下降至平稳;而在高压灭菌条件下，在藻的生长前期COD下降很慢，但第6天开始迅速下降，原因为紫外灭菌污水培养中是菌藻共生，两者的共同作用使得COD在生长初期降解较快.但高压灭菌方式下，生长后期COD也出现相同的降低，说明该小球藻适应于有机质环境后也可有效降解COD.高压灭菌后培养的藻的生物量远高于紫外灭菌灭菌培养的藻，原因为紫外灭菌在培养的过程中存在菌藻共生，菌在生长中消耗有机营养元素与藻产生了竞争，从而不利于蛋白核小球藻生物量的积累，2种灭菌方式后培养的小球藻的油脂产量相差不大，基于生产成本及实现大规模培养考虑，紫外灭菌方式更具有可行性.

通过色谱分析显示，蛋白核小球藻脂肪酸的组成主要是十六碳脂肪酸和十八碳脂肪酸，其中紫外与高压灭菌方式下后培养的藻中的单不饱和脂肪酸的量分别为23.22%和20.67%，有利于油脂的稳定性，且其组成与植物油脂相似，可以作为制备生物柴油的原料.

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