通光散汤对小鼠哮喘模型气道高反应性和气道炎症的影响

刘 蓉，赵 瑾，陈国勤，张新凤，陆洁萍，李洪涛

（1.呼吸疾病国家重点实验室（广州医学院）；2.广州医学院第一附属医院，广州 510120）

通光散又名扁藤，为云南地方草药，性味苦寒，具有清热解毒，止咳平喘的作用［1-3］。但目前还没有单味中药通光散治疗哮喘的基础实验研究。为开发我国特有的中草药资源，我们在建立小鼠哮喘模型的基础上，利用Buxco小动物肺功能仪等先进的仪器设备和方法，确定其对哮喘动物模型气道高反应和气道炎症的影响，探讨通光散治疗哮喘的可能机制，为通光散的开发应用提供必要的基础研究。

1 材料和方法

1.1 材料

鸡卵白蛋白OVA（Grade V，美国Sigma公司），氢氧化铝凝胶（美国Sigma公司），低温离心机（Bec km an，美国），光学显微镜及Nikon数码摄影一体化系统（Nikon，日本），小动物肺功能仪（Buxco，美国）。

1.2 中药

通光散，购自昆明福林堂中药饮片有限公司（生产许可证号：滇Y20050050）。通光散汤：通光散120 g，加水1 000 m L，文火煎至200 m L，每毫升含生药量约0.6 g。

1.3 实验动物与模型建立

35只SPF级6周龄雌性BALB/c小鼠，体重16～19 g，合格证号：0082361，由广东省医学实验动物中心提供。小鼠分笼饲养于广州医学院第一附属医院动物实验室屏障环境（许可证号：SYXK（粤） 2008-0093），动物自由进食颗粒饲料和纯净水。小鼠随机分为正常对照组（NS，n=10）、模型组（Asthma，n=13）和药物实验组（Experiment，n= 12）。以OVA首次致敏为0 d，模型组和药物组分别于第0、7、14天每只小鼠分别腹腔注射致敏液OVA200μL（0.04％OVA-NS 50μL与150μL液态铝混合）；对照组腹腔注射200μL生理盐水（NS）。第15天后，药物组每天灌胃给予通光散汤0.72 m L （20 g/kg体重，约合儿童每天用量的10～15倍），对照组和模型组则以与药物组等量的生理盐水（NS）灌胃。于第28、29、30天，以戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后，模型组和药物组每只小鼠以OVA（0.4％溶液50μL）滴鼻，利用小鼠自然呼吸将液滴吸入气道；对照组用等量的NS滴鼻，1次/d。

1.4 气道反应性的测定

末次激发48 h后，用小动物肺功能仪无创法测定小鼠的气道阻力［4，5］，结果以增强的呼吸间歇（enhanced pause，Penh）表示。首先记录小鼠气道阻力的基础值（Baseline）1 min，随后测定30μL生理盐水（NS）和30μL倍增浓度的乙酰甲胆碱（Mch）雾化激发小鼠气道后气道阻力的变化，每次雾化1 m in，记录3 min。Mch激发梯度浓度分别为3.12、6.25、12.5、25、50和100 mg/m L。以NS的Penh值为标准值，将各个浓度Mch的Penh与标准值的比值（Penh/NS）作为气道反应性统计指标。

1.5 肺泡灌洗液（BALF）收集及细胞计数

小鼠麻醉处死后仰卧位固定，行气管插管手术，以0.8 m L PBS缓冲液灌洗肺泡3次，回收率在80％以上。BALF细胞沉淀作涂片，10％中性甲醛溶液固定后HE染色，连续计数400个细胞并进行细胞分类，计算各细胞的百分比构成。

1.6 肺组织病理学观察

将左肺上叶分离，10％中性甲醛溶液固定24 h以上，石蜡包埋，切片，HE染色和PAS染色后行肺组织病理观察。HE染色切片参考Henderson的方法按以下标准半定量评定支气管/血管周围炎症细胞浸润程度［6，7］：-（0分）：支气管/血管周围几乎无炎症细胞；+（1分）：支气管/血管周围散在少许炎症细胞；++（2分）：支气管/血管周围较多分布不均的炎症细胞但未聚集成团；+++（3分）：支气管/血管周围大量炎症细胞，分布较均匀，但少见聚集成团；++++（4分）：支气管/血管周围大量炎症细胞聚集成团。

1.7 统计学方法

所有数据用均数±标准差表示，组间比较采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，方差齐用最小显著差异法（LSD），当方差不齐时用Tamhane＇s T2法。在造模过程中死亡及感染的动物不列入统计。

2 结果

2.1 一般情况观察

OVA激发前，即28 d之前，三组小鼠状态表现正常，体重增加。在第28天用OVA激发后，模型组和药物组动物毛色失去光泽，蓬松，从小鼠体重有明显下降（图1）。对照组小鼠激发过程中未出现明显的上述表现。模型组和药物组在OVA激发过程中分别有2只和3只小鼠死亡，主要原因可能是麻醉过深、滴鼻后导致窒息死亡。

图1 小鼠体重变化曲线Fig.1 Body weight changing curve of the mice

2.2 小鼠气道阻力（Penh/NS）的变化

小鼠气道阻力的变化见表1。

2.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞总数、细胞分类的变化

模型组BALF中细胞总数和Eos（％）较对照组明显增加，模型组中Eos（％）接近70％（P＜0.01）（表2）。

2.4 小鼠肺组织病理变化

小鼠肺组织病理变化见图2（见彩插4）.

3 讨论

支气管哮喘（Asthma，以下简称哮喘），又称气道变异性炎症（AAl），是最常见的以气道高反应性和气道通气障碍为特征的慢性呼吸道疾病，被世界医学界公认为四大顽症之一［7］。目前哮喘的防治均采用局部疗法，应用包括糖皮质激素在内的抗炎药物。但是由于激素的副作用，使其在应用上受到限制，特别对于儿童病人。通光散（Marsdenia tenacissima）是萝藦科牛奶菜属植物［1］，广泛分布于亚洲的热带和亚热带地区，包括我国的云南、贵州等地。其活性成分不仅具有抗癌的作用，而且具有平喘作用［10］。据《云南抗癌中草药》记载［2］：通光散别名乌骨藤，具有味苦，清热、解毒、止咳平喘、散结止痛的作用。《广西药用植物名录》通光藤茎止咳，祛痰，平喘，用于慢性支气管炎［3］。通光散价格便宜，购买也很方便。长期以来作为主药用于哮喘病人的治疗［9］。但是缺少临床前的基础研究特别是药效学的研究。本实验首先建立小鼠哮喘模型，利用Buxco小动物肺功能仪对哮喘动物模型气道高反应测定，同时结合病例分析，观察其对小鼠模型气道炎症的影响。结果表明：与对照组比较，哮喘模型动物具备气道高反应性；小鼠哮喘模型BALF中白细胞较对照组明显增多，Eos的比例接近70％，支气管及血管周围大量炎性细胞浸润，肺间质及肺泡腔内可见嗜酸细胞浸润，气道分泌大量黏液，说明哮喘模型的建立是成功的。虽然BALF总数与其他报道略有不同，原因可能与方法不同有关，但不影响对结果的判断。实验组的结果与模型组有明显差异，与对照组接近，说明TGS对于抑制哮喘气道高反应性和气道炎症的效果是十分明显的。

表1 小鼠经乙酰甲胆碱（Mch）激发后气道阻力（Penh/NS）的变化Tab.1 Changes of airway resistance（Penh/NS）in mice after Mch stimulation in the three groups（±s）

表1 小鼠经乙酰甲胆碱（Mch）激发后气道阻力（Penh/NS）的变化Tab.1 Changes of airway resistance（Penh/NS）in mice after Mch stimulation in the three groups（±s）

＊P＜0.05 vs.asthma group.

组别Group乙酰甲胆碱Mch（mg/mL） 3.12 6.25 12.5 25 50 100正常对照组Normal 1.12±0.12 1.35±0.22* 1.73±0.31* 3.45±0.61* 4.57±0.45* 5.23±1.21*哮喘模型组Asthma 1.31±0.31 2.06±0.63 3.24±0.7 4.69±0.27 6.58±0.79 8.53±1.1药物治疗组Experiment 1.29±0.23 1.46±0.31* 2.18±0.44* 3.32±0.49* 4.83±0.66* 5.57±0.66*

表2 三组BALF细胞总数及细胞分类的变化Tab.2 The total cell numbers and types of BALF in mice of the three groups（±s）

表2 三组BALF细胞总数及细胞分类的变化Tab.2 The total cell numbers and types of BALF in mice of the three groups（±s）

P＜0.05 vs.asthma group.

组别Groups BALF细胞总数The total cells of BALF嗜酸粒细胞Eos单核细胞Mac淋巴细胞Lym粒细胞Neu （×104/m L）（％）（％）（％）（％）正常对照组NS 3.21±2.58* 0.08±0.15* 70.88±18.82* 10.52±12.79* 17.85±19.46*哮喘模型组Asthma 14.59±8.60 69.22±7.87 24.00±7.91 2.67±1.48 4.11±1.87药物治疗组Experiment 5.32±2.02* 2.12±0.18* 61.81±20.52* 15.98±12.67* 20.09±19.85*＊

嗜酸性粒细胞是支气管哮喘发病的主要效应细胞，能释放炎症介质及炎症蛋白颗粒，引起气道高反应性及炎症反应。本实验观察到哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞的百分比明显升高，肺病理切片也可见细支气管壁黏膜水肿、增厚，肺泡及细支气管中有大量炎性细胞浸润，嗜酸性粒细胞可产生多种细胞因子和炎性介质，引起气道上皮损伤和气道高反应性。其释放的氧化产物可破坏肺周围组织的完整性。嗜酸性粒细胞释放的炎性介质又可促进单核细胞、淋巴细胞及嗜酸性粒细胞本身的募集作用［8］，中药TGS可明显减少嗜酸性粒细胞的渗出，本实验数据显示，给药TGS后，BALF中EOS数目可明显减少，肺组织病理学观察可见肺部炎症减轻，表明TGS具有抗气道炎症作用，由此可推断TGS平喘机制之一可能与抑制炎症细胞的渗出有关。

本研究建立的小鼠哮喘模型，符合哮喘发作期可逆性气流受限及气道高反应典型特征。实验观察到通光散汤可显著抑制哮喘小鼠气道高反应性，改善肺功能，具有抗哮喘作用。

（致谢：感谢张秀兰医生的支持和帮助!）

［1］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［M］.北京：人民卫生出版社.1978：441.

［2］胡月英，宣明盛.云南抗癌中草药［M］.昆明：云南人民出版社.1982：68-69.

［3］广西壮族白治区中医药研究所.广西药用植物名录［M］.南宁：广西人民出版社.1986：377.

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［5］姜华，赖克方，沈璐，等.卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）对哮喘小鼠气道炎症和气道反应性的影响［J］.国际呼吸杂志，2010，4（30）：409-413.

［6］Ohki Y，Tokuyama K，Mayuzumi H，et al.Characteristic features of allergic airway inflammation in a murine model of infantile asthma［J］.Int Arch Allergy Immunol.2005.138 （1）：51-58.

［7］Mayuzumi H，Ohki Y，Tokuyama K，et al.Age-related difference in the persistency of allergic airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma［J］.Int Arch Allergy Immunol.2007，143（4）：255-262

［8］Glaab T，Daser A，Braun A，et al.Tidalmidexpiratory flow as a measure of airway hyperresponsiveness in allergic mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280（3）：L565 -L573.

［9］阮江华，张秀兰，尹淑丽，等.通光散汤治疗小儿哮喘53例［J］.新中医，2003，35（6）：60-61.

［10］李延芳，廖文斌，马丽芳，等.通光散化学成分和药理活性的研究进展［J］.时珍国医国药，2007，18（7）：1761-1763.