当归多糖对不同化学性肝损伤的干预作用

刘娟

当归多糖对不同化学性肝损伤的干预作用

刘娟

目的观察纯化当归多糖对酒精性及四氯化碳性肝损伤的干预作用,并探讨其初步机制。方法分别采用乙醇及四氯化碳制造小鼠肝损伤模型,给予纯化当归多糖,按 100mg/kg和200mg/kg口服给药进行干预。观察血清 sALT、sAST的变化;测定抗氧化指标 SOD、MDA、GSH的含量;以苯胺羟化酶反映 CYP2E1活性。结果当归多糖两剂量组均可降低酒精性及四氯化碳性肝损伤模型组的sALT、sAST,减轻肝脏损伤;两组引起的抗氧化功能下降均可被当归多糖不同程度的抑制;当归多糖可抑制乙醇所致的 CYP2E1上调,但对四氯化碳所致的 CYP2E1酶活性降低却无明显影响。大剂量组的上述作用更为明显。结论纯化当归多糖对不同化学性肝损伤均有明显的干预作用,但其干预能力因保护机制不同而有所差别。

当归多糖;乙醇;四氯化碳;肝损伤;CYP2E1

肝损伤是临床常见的症状,许多因素如病毒、药物、酒精等均可导致肝损的产生,若诊治不当,会导致肝衰竭,引起严重后果。现代医学对肝损的研究比较深入,已从多方面探讨了其发生机制,并研制了抗脂质过氧化剂、抗免疫反应剂等保肝药物,但有些因其不良反应或疗效不够理想而限制了临床使用。多糖作为一种天然活性成分,低毒价廉的优势使其具有广泛的应用前景。目前已证实,芦根多糖、云芝多糖和枸杞多糖均具有良好的护肝作用[1,2]。

当归多糖(ASP)是从我国的一味传统中药当归中提取的重要活性成分,研究表明其具有丰富的生物学活性,包括影响造血系统、调节免疫、抗肿瘤等等[3,4]。本文从甘肃岷县新鲜当归中提取分离了含量较高的 ASP,分别观察其对酒精性及四氯化碳性肝损伤的作用如何,并对其可能的机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 药品 制备纯化当归多糖:甘肃岷县新鲜当归,经水煮-醇沉法得当归粗多糖,经 Sevag法去蛋白,醇沉,冷冻干燥10h,所得当归多糖为浅米灰色疏松状粉末,测得其总糖含量为 96.8%。

1.2 试剂 氧化型辅酶Ⅱ;还原型谷胱甘肽;1-氯-2,4-二硝基苯;二硫双硝基苯甲酸均为 Sigma产品;sALT、sAST、SOD及MDA等测定试剂盒,均为南京建成生物工程研究所;余均为市售分析纯产品。

1.3 动物 健康♂昆明种小鼠,SPF级,体重 20～22g。湖北省医学科学院实验动物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 酒精性肝损伤模型的建立及处理 小鼠随机分为四组:空白对照组;酒精模型组;ASP小剂量组(100mg/kg)及大剂量组(200mg/kg),i.g.给药,qd×10d,其余动物给予等容量生理盐水。末次给药后 4h除空白对照,其余三组均给予 56%酒精 6.64g/kg i.g.,禁食不禁水,19h后重复一次。6h后,处死动物。

1.4.2 四氯化碳性肝损伤模型的建立及处理 小鼠随机分为四组:空白对照组;CCl4模型组;ASP小剂量组(100mg/kg)及大剂量组(200mg/kg),i.g给药,qd×10d,其余动物给予等容量生理盐水。末次给药后 4h,各组均按CCl40.15mg/kg剂量灌胃,空白对照给予等容量生理盐水。6h后,动物断头处死。

1.4.3 标本制备 小鼠摘眼球取血,制备血清,置于-20℃保存。迅速剖腹取肝脏,置于冰冻生理盐水中反复漂洗,滤纸吸干,称重。采用 Tris-HCl 50mmol/L,pH 7.4制备肝匀浆。9000g离心 20min,取上清液为 S9组分,于-80℃保存。

1.4.4 检测指标 赖氏法测定血清 sALT及 sAST活性。黄嘌呤氧化酶法测定 SOD活力。TBA法测定MDA含量。DTNB比色法测定GSH含量。测定肝 S9的苯胺羟化酶以反映CYP2E1活性。

2 结果

2.1 ASP对急性酒精性肝损伤小鼠的干预作用

2.1.1 ASP对小鼠sALT、sAST及肝脏指数的影响 酒精模型组小鼠 sALT、sAST较空白对照组上升 83.8%及 133.7%(P均 ＜0.01),肝脏指数明显增大(P＜0.01),反映了短期急性摄入乙醇所产生的肝脏损害。与模型组相比,两剂量组ASP均可显著抑制酒精所致小鼠 sALT(分别降低 25.2%、35.3%)及 sAST水平 (分别降低 31.8%、34.4%)的上升幅度,并使肝脏指数保持正常(表1)。

表1 ASP对急性酒精性肝损伤小鼠 sALT、sAST及肝脏指数的影响

2.1.2 ASP对小鼠肝 S9组分 GSH、SOD及 MDA活性的影响 结果可见,模型组小鼠 MDA含量显著增高,GSH、SOD活性明显下降。ASP100mg/kg、200mg/kg对上述指标的改变均有一定程度的缓解,其中大剂量ASP的作用似乎更为显著(见表2)。

表2 ASP对急性酒精性肝损伤小鼠 GSH、SOD及 MDA的影响

2.1.3 ASP对小鼠肝脏 CYP2E1活性的影响已知乙醇为CYP2E1诱导剂,其活性增加与乙醇肝毒作用有关。本文结果显示,模型组 CYP2E 1酶活性升高(1.4倍),ASP100mg/kg对 CYP2E1有一定的抑制趋势,而 200mg/kg剂量组则明显抑制了 CYP2E 1的上调,与模型组相比具有显著性差异。(图1)＜0.01

图 1ASP对急性酒精性肝损伤小鼠 CYP2E 1活性的影响

2.2 ASP对急性四氯化碳性肝损伤小鼠的干预作用

2.2.1 ASP对小鼠sALT、sAST及肝脏指数的影响 结果显示,CCl4模型组小鼠 sALT、sAST分别上升至空白对照组的11.0倍及 9.5倍(P均＜0.01),表明肝脏严重受损,但肝脏指数无明显变化。与模型组相比,ASP两剂量组均抑制了CCl4所致小鼠 sALT(分别降低 14.4%、15.3%,P均 ＜0.01)及 sAST水平 (分别降低 11.1%、17.8%,P均 ＜0.01)的上升幅度(表3)。

表3 ASP对四氯化碳性肝损伤小鼠 sALT、sAST及肝脏指数的影响

2.2.2 ASP对小鼠肝 S9组分 GSH、SOD及 MDA活性的影响 结果可见,模型组小鼠 SOD、GSH活性明显下降,MDA含量则显著增高。给予 ASP 100mg/kg、200mg/kg进行干预后,SOD活性较模型组分别上升了 7%(P＜0.05)和 11.5%(P＜0.01),呈现出一定程度的剂量关系;GSH则恢复至对照组的 83.2%和 84.2%(P均＜0.05);MDA的增高亦有部分逆转,分别下降至模型组的 95.0%及 93.7%(P均 ＜0.05)。 (表4)

表4 ASP对四氯化碳性肝损伤小鼠 GSH、SOD及 MDA的影响

2.2.3 ASP对小鼠CYP2E1活性的影响 结果显示,四氯化碳性模型组 CYP2E 1酶活性仅为正常组的 9.2%,与文献报道相符[5]。Wong等人的实验表明,CCl4能够抑制 CYP2E1蛋白合成,降低其酶活性。但 ASP 100mg/kg及 200mg/kg剂量组对 CYP2E1酶活性均无明显影响。(图 2)

图 1ASP对四氯化碳性肝损伤小鼠 CYP2E 1活性的影响

3 讨论

急性酒精性中毒是临床上造成肝损伤的常见原因,这与乙醇在肝脏内经 CYP2E1催化后生成的毒性产物乙醛有关。实验结果显示,ASP能明显抑制乙醇所致的血清转氨酶升高,减轻肝损程度,而这种保护作用很可能与 ASP能特异性下调乙醇对 CYP2E1水平的诱导有密切关系:当 CYP2E1活性降低时,将减少乙醛及自由基的生成,从而有利于减轻酒精对肝细胞的损害。此外,ASP部分恢复抗氧化功能也应是ASP对抗酒精性肝毒的原因之一。

四氯化碳作为一个典型肝毒物质,进入体内后主要经肝脏CYP2E1代谢,生成 CCl3等产物。自由基可诱发膜脂质过氧化,并与蛋白质大分子进行共价结合,从而破坏肝细胞膜结构与功能的完整性,干扰了蛋白质的合成。实验结果显示,预先给予ASP处理,能有效抑制四氯化碳所致的血清酶漏出。ASP的这种保肝机制可能是由于其抑制肝细胞脂质过氧化反应,稳定生物膜,从而降低膜的通透性,使肝细胞变性和坏死减轻,并迅速恢复肝细胞的功能。上文已提及,CYP2E1参与了 CCl4的肝毒形成机制,但关于 CCl4对CYP2E1活性的影响,文献报道不一。有研究结果显示[5],CYP2E1活性明显降低,认为可能是由于在代谢过程中被CCl4降解所致;也有人认为 CCl 4对 CYP2E 1的 mRNA及其蛋白有着显著的诱导作用[6]。本文实验结果可见,CCl4模型中 CYP2E1活性极度抑制,与前者一致。由于 ASP未影响CYP2E1的水平,提示此酶并非ASP保护 CCl 4性肝损伤的作用环节,还应存在其他途径,尚需进一步研究。

综上所述,ASP对两种肝损模型的症状均有不同程度的缓解,其中对酒精性肝损的保护作用要更为显著,提示 ASP对不同化学性肝损伤皆有干预作用,但其干预能力因保护机制不同而有所差别。

[1] 张国升,凡明月.芦根多糖对四氯化碳小鼠肝损伤的保护作用.中国药理学通报,2002,18(3):354-355.

[2] 孙设宗,唐微.云芝多糖对小鼠实验性肝损伤保护作用的研究.中国现代医学杂志,2008,18(9):1217.

[3] 华自森,王建伟,宋姝丹,等.当归多糖对 K 562白血病细胞JAK 2、STAT3表达和活化的影响.解剖学杂志,2009,32(1):8-11.

[4] 孙文平,罗红,杨光,等.当归多糖激发免疫反应的特征研究.大连医科大学学报,2009,31(2):262-264.

[5] Wong FW,ChanWH,Lee SS.Resistance to carbon tetrachloride induced hepatotoxicity in mice which lack CYP2E 1expression.Toxicol Appl Pharmacol,1998,153:109-118.

[6] Ha KT,Yoon SJ,ChoiDY,Kim DW,Kim JK,Kim CH.Protective effect of Lycium chinense fruiton carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity.JEthnopharmacol,2005,96(3):529-535.

430065武汉科技大学医学院药学系