大黄素对Cx32组成的细胞缝隙连接通讯功能的影响

吕显林 王琴 陈清 陶亮

大黄素对Cx32组成的细胞缝隙连接通讯功能的影响

吕显林 王琴 陈清 陶亮

目的在转染并稳定表达Cx32的Hela细胞上，观察大黄素对Cx32的GJIC以及Cx32蛋白表达水平的影响。方法 采用SRB法检测不同浓度大黄素对Hela细胞的毒性;用细胞接种荧光示踪法(“parachute”dye-coupling assay)观察不同浓度大黄素对GJIC的影响;用western blot法研究大黄素在影响GJIC功能浓度范围内对Cx32蛋白表达的影响。结果大黄素在0～1μmol/L浓度时对Hela细胞无毒性作用;大黄素(24～600nmol/L)预处理4 h，能浓度依赖性地增强GJIC及Cx32蛋白表达量。结论大黄素能够增强Cx32的细胞GJIC;此增强作用可能与其增加Cx32蛋白表达水平有关。

大黄素;缝隙连接蛋白;缝隙连接通讯

细胞缝隙连接(gap junction，GJ)是相邻细胞间的一种蛋白质通道结构。该通道两端分别开口于相邻的细胞胞浆中，由各自细胞包膜上6个连接蛋白(connexin，Cx)围绕中央孔组成的“半通道”对接而成。其重要功能是缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication，GJIC)，沟通相邻细胞的胞浆，允许细胞浆中分子量＜1kDa的小分子物质，包括细胞代谢产物及细胞第二信使等通过，从而同步细胞活动、协调各细胞间活性和功能、控制细胞的生长和发育等生命过程［1］。GJ通过Cx结构和功能的变化而导致的细胞间信号转导异常，与神经系统疾病、心血管疾病、肿瘤、视力和听力障碍的发生密切相关［2，3］。因此，能纠正GJ功能异常的化合物有望成为治疗上述疾病的新型药物［4］。

大黄素具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化及清除氧自由基和保肝作用，还可抑制多种肿瘤细胞增殖，增强药物的细胞毒性作用，但其对GJ功能及Cx蛋白表达的影响尚未见报道。本文旨在研究大黄素对Cx32组成的GJ功能的影响。

1 资料与方法

1.1 试剂 大黄素购于自中国药品检验所;抗HA抗体购自Sigma;多西环素购自Calbiochem;HRP标记的羊抗小鼠二抗、硝酸纤维素膜(NC膜)购于Amersham;ECL-plus化学发光剂购于Bio-rad;Calcein-AM和CM-DIL购自Molecular Probes。

1.2 细胞培养 本实验用含有Cx32 cDNA的PBI质粒转染Hela细胞，通过多西环素诱导，使HeLa细胞稳定表达Cx并形成有效的GJIC。转染并稳定表达Cx32的HeLa细胞于含10%新生牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养液，37℃、含5%CO2的细胞培养箱中常规培养，实验前将细胞用细胞诱导培养液培养48 h。

1.3 SRB法测定药物的细胞毒性［5］调整细胞浓度为2×103/ml，接种于 96孔板(200μl/孔)，空白为培养液。37℃，5%CO2孵育24 h后。加入不同浓度的大黄素作用4 h，更换新鲜培养液继续培养48 h。吸出培养液，缓慢加入10%三氯醋酸(200μl/孔)，4℃静置1 h。PBS冲洗，加入 SRB染色液(100μl/孔)，37℃，染色 30 min。1% 醋酸洗涤，加入 10 mmol/LTris液(150μl/孔)，振动5 ～10 min，直至染料全部溶解。酶标仪564nm波长处测定OD值。重复3次。

1.4 细胞接种荧光示踪法(Parachute Assay)［6］将表达Cx的Hela细胞与荧光指示剂calcine-AM和DiI-CM共同孵育，使其进入细胞，为“供体细胞”(donor cell)。将“供体细胞”接种到有相同表达Cx的Hela细胞(“接受细胞”，receiver cells)上，培养4 h后，显微荧光系统观察。计数1个“供体细胞”周围含有calcine的“接受细胞”数作为GJ功能指标。

1.5 Western Blot Hela细胞用冷PBS洗3次，加入细胞裂解液静置2 h，12000r/min，4℃离心30 min，取上清。取30μg 蛋白经上样缓冲液变性处理，在含10%SDS-PAGE凝胶中电泳，然后电转于硝化纤维素薄膜上。含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，加入鼠抗HA抗体(1：1000)4℃过夜。洗膜后，加入HPR标记的羊抗鼠抗体(1：3000)室温孵育2 h，应用化学发光系统显色，放射自显影于X光胶片上，凝胶成像系统分析特异电泳条带的灰阶密度值。为使上样量一致，相同的薄膜用小鼠抗人β-actin多克隆抗体(1：5000)进行杂交染色。

1.6 统计学方法 实验结果使用SPSS13.0软件进行分析。计量资料两组之间比较用t检验，多组之间比较用ANOVA分析，组间比较用LSD法，P＜0.05认为有统计学意义。统计图表用SigmaPlot10.0绘制。

2 结果

2.1 药物对Hela细胞生长的影响 为排除药物本身的细胞毒性或细胞增殖作用对GJ功能的影响，采用SRB法测定不同浓度大黄素对Hela细胞增殖的作用。结果提示，大黄素在0～1μmol/L范围内不影响Hela细胞存活率(图1)。

图1 大黄素对表达Cx32的Hela细胞存活率的影响

2.2 大黄素能够增强由Cx32组成的GJ的功能 采用细胞接种荧光示踪法(Parachute Assay)，分别测定不同浓度的大黄素对细胞GJ功能的影响(见图2A、2B)。结果显示，大黄素(24～600nmol/L)作用4 h，GJ介导的细胞间荧光传递呈浓度依赖性地增加，浓度0.6μM时，增强率达176%(图2C)。

图2 大黄素对由Cx32组成的GJ功能的影响

2.3 大黄素对Cx32蛋白表达的影响 采用免疫印迹法(western blotting)检测大黄素对Cx32蛋白表达的影响。大黄素(24～600nmol/L)预处理4 h，可浓度依赖性地增强Cx32蛋白的表达(见图3)。

图3 大黄对Cx32的蛋白表达的影响

3 讨论

本研究首次证明，大黄素可以浓度依赖性地增强Hela细胞的GJ功能和Cx表达，但调控Cx32蛋白表达的机制尚未清楚，仍有待进一步研究证实。现已知多种因素能够调节GJ功能，主要包括：直接控制Cx通道的启闭、调控Cx蛋白的表达、通过Cx磷酸化/去磷酸化等进行表达后修饰，其中细胞Cx蛋白的表达量是主要因素。文献报道，姜黄素类似物，大多数类黄酮化合物红桔素，蒜臭素［7］，人参、丹参酮［8］等对GJ功能均有一定的调节作用，作用机制可能与下调腺苷酸环化酶活性，上调蛋白激酶C，诱导Cx的磷酸化有关［9，10］。据报道，GJ能显著增强顺铂和依托泊苷引起的细胞凋亡［11］，增强顺铂抑制膀胱癌细胞生长、减少BCL-2表达和引起细胞凋亡的作用［12］。因此，能增强GJ功能的药物可能具有抑制肿瘤生长和增强抗肿瘤药物疗效的双重作用。

最新发现，大黄素具有抑制肿瘤细胞增殖和抗肿瘤转移的潜能，能增强药物的细胞毒性作用，如可显著增强5-氟尿嘧啶诱导的HepG2细胞凋亡［13］;增强顺铂抑制HepG2胞增殖的效应;增强三氧化二砷诱导肿瘤细胞凋亡的作用［14］。本研究首次证明大黄素能够增强GJ功能。这一发现提示，大黄素有可能通过增强GJ功能而增强药物的抗肿瘤作用。

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The effect of Emodin on the function of gap junction composed of Cx32

LV Xian-lin，WANG Qin，CHEN Qing，et al.Department of Pharmacy，Hengli People’s Hospital of Dongguan city，Dongguan 523460，China

ObjectiveTo investigate the effect of Emodin on gap junction intercellular communication and the expression of Cx32 protein in Cx32-transfected Hela cells.MethodsSRB assay was used to detect the cytotoxicity of emodin on Hela cells.The function of GJIC was determined by“parachute”dye-coupling assay;Western blot was performed to detect the expression of Cx32.ResultsEmodin with concentration of 0～1μmol/L had no cytotoxicity on Hela cells;Pre-treatment the cells with Emodin with concentration of 24～600nmol/L for 4 hours could increase the intercellular dye transfer and the Cx32 protein expression.ConclusionEmodin could enhance the function of gap junction in Cx32-transfected Hela cells，probably through increasing the Cx32 expression.

Emodin;Connexin;Gap junction intercellular communication

523460 东莞市横沥人民医院药剂科(吕显林);中山大学医学院药理学教研室(王琴 陶亮);中山大学附属第一医院药学部(陈清)