缺氧对食管癌细胞缺氧诱导因子-1α及己糖激酶表达的影响

唐娜娜 朱宏 施瑞华

缺氧对食管癌细胞缺氧诱导因子-1α及己糖激酶表达的影响

唐娜娜 朱宏 施瑞华

目的探讨不同缺氧程度对食管癌细胞株TE1中缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)及糖酵解关键酶表达的影响。方法 TE1细胞分别在正常氧分压和缺氧条件下培养，缺氧时间设定为6、12、24及48 h，使用Western blot方法检测缺氧培养不同时间后细胞中HIF-1α及糖酵解关键酶己糖激酶II(Hexokinase-II，HK-II)的蛋白水平表达变化。结果常氧及缺氧条件下TE1细胞中HIF-1α及HK-II均有表达，缺氧后表达均较常氧培养时明显增强，且随缺氧时间不同而呈先增多后减少的动态变化。结论低氧能够增加食管癌细胞中HIF-1α及HK-II表达而促进糖酵解进程，联合抑制HIF-1α和糖酵解酶可能成为治疗食管癌的潜在的靶点。

缺氧诱导因子-1α;糖酵解;食管癌

缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)是新近发现的与肿瘤血管生成、转移和浸润密切相关的分子［1］，但其在细胞中的调控机制目前认识还不一致。近年研究提示HIF-1α的表达及调控可能涉及糖酵解相关基因。为进一步明确HIF-1α及糖酵解的调控机制，本研究拟观察缺氧对HIF-1α及糖酵解的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 TE1细胞株(中国科学院上海细胞所)，DMEM培养液;鼠抗人HIF-1α单抗;兔抗人HK-II;鼠抗人Tubulin-α单抗;HRP标记的羊抗鼠二抗;HRP标记的羊抗兔二抗;

1.2 方法

1.2.1 食管鳞癌TE1细胞培养 取对数生长期TE1细胞贴壁传代，后随机分为正常氧分压组和缺氧组，正常组置入含5%CO2的37℃培养箱，缺氧组置入缺氧培养箱(37℃、1%O2、5%CO2、94%N2)，缺氧时间为 6、12、24、48 h，细胞裂解液收集各组细胞。

1.2.2 Western blot方法测定 HIF-1α、HK-II表达 取蛋白40μg上样，行 SDS-PAGE电泳，冰浴电转至NC膜，封闭后依次加入一抗(HIF-1α 1：500;HK-II 1：1000;Tubulin 1：4000)、二抗(羊抗鼠1：4000;羊抗兔1：4000)，ECL发光法曝光显影。Tanon Gis软件对感光胶片条带进行灰度值分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行数据整理和分析，组间差异采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

缺氧培养6、12、24、48 h 后，HIF-1α 及HK-II表达较常氧培养明显升高(P＞0.05)，缺氧12 h表达到达高峰，随着缺氧时间延长其表达又逐渐下降(图1)。

图1 缺氧培养不同时间后HIF-1α、HK-II的蛋白表达情况

3 讨论

缺氧诱导因子-1是一种核转录因子，是细胞在缺氧条件下维持氧稳态的关键物质［2］。HIF-1由α和β亚基组成，其活性取决于其α亚基。HIF-1α的调控机制尚不清楚，本研究结果显示，TE1细胞常氧状态下即有HIF-1α表达，缺氧后表达明显增强，提示肿瘤细胞内HIF-1α蛋白水平受环境氧浓度的高度调控。

恶性实体肿瘤生长迅速常造成肿瘤内部微环境的缺氧状态，肿瘤细胞依赖糖酵解获得能量的特点是其缺氧耐受的代谢基础［3］。HK-II是影响糖酵解的关键基因［4］，本实验显示低氧能够促进HK-II表达，从而促进糖酵解进程。

有学者提出PI3K/AKT通路是HIF-1α的主要调控机制［5］，而HIF-1α可调节糖酵解水平。通过本研究我们推测HIF-1α可能通过调控HK-II进而影响糖酵解，联合抑制HIF-1α和HK-II可能为肿瘤糖酵解途径的一个新的治疗靶点。

［1］ Jie Hua，Rui-Hua Shi，Hong-Jie Zhang，et al.Effect of RNA interference-based silencing of HIF-1α gene on the expression of vasculogenic mimicry-associated genes in esophageal squamous carcinoma cells.World Chinese Journal of Digestology，2009(19)：1913-1918.

［2］ Matsuyama T，Nakanishi K，Hayashi T，et al.Expression of hypoxia-inducible factor-1α in esophageal squamous cell carcinoma Cancer Science，2005，96：3(176-182).

［3］ Pelicano H，Martin DS，Xu RH，et al.Glycolysis inhibition for anticancer treatment.Oncogene，2006，25(34)：4633-4646.

［4］ Airley RE，Mobasheri A.Hypoxic regulation of glucose transport，anaerobic metabolism and angiogenesis in cancer：novel pathways and targets for anticancer therapeutics.Chemotherapy，2007，53(4)：233-256.

［5］ Burrows N，Resch J，Cowen R.L，et al.Expression of hypoxia-inducible factor 1α in thyroid carcinomas Endocrine-Related Cancer，2010，17：1(61-72).

Influence of hypoxia on hypoxia-inducible factor-1α and Hexokinase-II in esophageal carcinoma

TANG Na-na，ZHU Hong，SHI Rui-Hua.Department of Gastroenterology，First Affilicated Hospital of NanJing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu Province，China

ObjectiveTo study the influence of hypoxia on hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α)and glycolysis associated protein in esophageal carcinoma TE1.MethodsEsophageal cancer TE1 were incubated under normoxic and hypoxic conditions for different time(6，12，24，48 h).Expressions of HIF-1α protein and the associated enzyme in glycolysis(HK-II)were detected by Western blot.ResultsHIF-1α and HK-II protein were both expressed in normoxic conditions.The expression of HIF-1α and HK-II increased after incubated in hypoxia environment，both reached perk at 12 h(P ＜0.05).ConclusionHypoxia condition can up-regulate the expression of HIF-1α and HK-II.Joint suppression of HIF-1α and key enzymes in glycolysis could become the potential targets for treatment of esophageal cancer.

Hypoxia inducible factor-1 alpha;Glycolysis;Esophageal cancer

国家自然科学基金资助项目(项目编号：30770991);国家自然科学基金青年基金资助项目(项目编号：30800511)

210029南京医科大学第一附属医院江苏省人民医院消化内科

施瑞华