肺炎支原体23SrRNA基因突变及其所致肺炎的临床分析

韩晓华，路素坤，李书秀，刘立云，陈宁，李书琴

（中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸科，沈阳 110004）

肺炎支原体23SrRNA基因突变及其所致肺炎的临床分析

韩晓华，路素坤，李书秀，刘立云，陈宁，李书琴

（中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸科，沈阳 110004）

目的了解肺炎支原体23SrRNA基因突变现状，提高对肺炎支原体大环内酯类抗生素耐药基因突变所致肺炎的临床认识和诊治水平。方法 对2009年5月至2009年10月我院住院的肺炎支原体肺炎患儿咽试子标本，应用巢式PCR扩增23SrRNA基因并进行电泳检测及DNA测序分析，筛选突变株；并进行总结和分析临床特点。结果 应用巢式PCR扩增23SrRNA测出基因序列45例，均存在大环内酯类抗生素耐药基因突变。且变异基因位点均为2063位A→G的点突变，其中2例为2063位点A/G双峰；临床特点表现为91.1%患儿持续性发热伴咳嗽，以中、高度热为主。68.9%外周血白细胞总数正常；45例患儿肺部影像资料显示，双肺炎症14例，大叶性肺炎7例，伴胸腔积液6例。20例有肺外合并症；45例应用红霉素静注治疗有效率91.1%。结论肺炎支原体大环内酯类抗生素作用位点之一23SrRNA2063普遍存在突变，其所致肺炎的临床表现无特异性；应用大环内酯类抗生素治疗91.1%有效，肺炎支原体此位点突变与其在体内是否耐药尚需进一步研究。

肺炎支原体肺炎；23SrRNA基因突变；临床表现；耐药性

近年来不断有肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）耐药基因突变的报道。日、中、法、美、德等国家均有研究发现，临床分离株中出现大环内酯类抗生素作用靶位23SrRNA的2063或/和2064位点突变，并在体外药敏试验中证实基因突变MP对大环内酯类抗生素耐药［1～6］。随着MP耐药基因突变的报道日益增多，突变MP所致肺炎在临床患儿有何表现及其治疗等问题已引起广大临床医生的关注。本文对我院确诊为肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）患儿 52例，采集咽试子标本行23SrRNA基因电泳检测及DNA测序，分析突变株基因状况，对突变MP所致肺炎的患儿临床资料进行分析，旨在提高对MP耐药基因突变所致肺炎的认识，观察大环内酯类抗生素治疗MP耐药基因突变肺炎临床疗效。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2009年5 月至10月于中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸病房住院的肺炎患儿180例，确诊为MPP患儿52例，其中45例咽拭子标本测出23Sr－RNA基因序列。男26例，女19例（男∶女=1.37∶1）；年龄为 6个月～12岁，平均年龄（4.67+3.33）岁。其中6个月～3岁15例，4岁～5岁14例，6岁～12岁16例。

1.2 诊断标准与方法

1.2.1 肺炎支原体肺炎诊断标准：小儿肺炎均符合《诸福棠实用儿科学》第7版诊断标准［7］，MP感染的诊断标准为：应用荧光探针定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术进行MP-DNA鉴定阳性，同时用颗粒凝集（particle agglutination，PA）方法检测血清肺炎支原体抗体，MP-Ab≥1∶160或对比2次采血抗体滴度增高4倍以上为阳性。

1.2.2 标本采集及仪器、试剂：在患儿入院当天用无菌生理盐水浸湿的无菌咽拭子适度用力擦拭患儿咽后壁，置于低温保存，用于FQ-PCR检测MP-DNA。同时采静脉血l ml低温保存，用于测定MP抗体（MP-Ab）。

SLAN荧光定量分析仪（上海宏石公司），MP核酸检测试剂盒（PCR－荧光探针法）购于上海复星医学科技发展有限公司，巢式PCR试剂购于大连宝生物有限公司，肺炎支原体抗体诊断试剂盒（凝胶颗粒法检测MP-Ab），Serodia MycoⅡ试剂盒。

1.2.3 巢式PCR扩增23SrRNA基因并进行电泳检测及DNA测序分析：以荧光定量PCR及MP抗体均为阳性的标本为模板，进行巢式PCR检测，对于其第2次扩增终产物经纯化后作双脱氧末端终止法全自动DNA测序（纯化和测序由南京金斯瑞生物技术公司ABI3730XL型测序仪完成），测得序列与美国国立生物信息中心（NCBI）检索的MP-23SrRNA基因序列作比对寻找突变位点。

1.2.4 其他检查：45例患儿均送检血、尿、便常规、ASO、C反应蛋白、肝肾功能、心肌酶谱及血清病毒IgM抗体（呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、EB病毒、腺病毒、艾柯病毒、柯萨奇病毒），全部患儿均行X线胸片或肺CT检查。

1.3 疗效判断标准

治愈：临床症状完全消失，肺部影像示阴影基本消失；好转：临床症状消失，肺部影像示炎症病灶大部分吸收；无效：仅用大环内酯类抗生素治疗后症状及肺部影像示肺部阴影均不见好转。

2 结果

2.1 MP标本的鉴定测序情况

180例住院患儿FQ-PCR和PA法均为阳性共52例，应用巢式PCR技术扩增MP-23SrRNA基因，并对扩增产物进行测序，测出45例，另7例PCR扩增弱阳性，基因测序为乱码，未能测出基因序列；此45例患儿MP-Ab达到1∶1280者37例，占82.2%；45例23SrRNA中均存在2063位A→G的点突变，其中2例为2063位点A/G双峰；考虑为敏感株与耐药株共存，突变率100%。MP测序结果见图1～3。

2.2 45例突变MP所致肺炎主要临床特点

2.2.1 一般临床表现：91.1%的患儿表现为持续性发热伴咳嗽。咳嗽病初多为刺激性干咳，后期多伴有痰液。6例无热或低热均为3岁以内患儿；入院时平均热程（6.09+3.25）d，总热程（8.58+4.23）d；51.1%患儿热程在6～9d，发热超过15d者4例，其中1例同时患有水痘，1例合并EB病毒感染，各年龄段患儿热程及体温具体分布见表1，表2。

2.2.2 肺部体征：肺部有喘鸣音者18例，占40.0%，其中3岁以下儿童12例；8例既往有喘息病史。肺部有湿罗音者30例，占66.7%。一侧呼吸音减弱者10例。

表145例患儿热程分布情况T a b.1F e b r i l e d a y s o f t h e 45MP Pp a t i n t s Febrile days n（%） Age（year）0～5 8（17.8） 2.13±2.036～9 23（51.1） 6.00±0.0010～14 10（22.2） 6.15±3.40≥15 4（8.9） 4.25±1.71表245例患儿体温分布情况T a b.2B o d y t e mp e r a t u r e 0f t h e 45p a t i e n t s Body temperature（℃） n（%） Age（year）36.0～37.2 4（8.9） 1.50±0.5837.3～38 2（4.4） 1.00±0.0038.1～39 24（53.3） 4.40±3.1039.1～41 15（33.3） 6.43±3.26

2.2.3 影像学检查：32例行肺部CT，均表现有肺内炎症，一侧炎性渗出、模糊斑片影18例，双肺炎症9例，5例表现为大叶实变，6例合并有胸腔积液，其中2例为双侧。13例行胸部X线检查，提示双肺纹理增强，模糊7例；一侧炎性渗出、模糊斑片影5例，大叶实变2例。

2.2.4 实验室检查：（1）31例外周血白细胞总数正常，占68.9%；其中24例伴有中性粒细胞比例较正常增高；余14例外周血白细胞总数有不同程度升高；尿常规中尿蛋白阳性1例；（2）血清测定EB病毒抗体阳性7例；肺炎衣原体抗体阳性4例；（3）CRP正常（≤8mg/L）23例，占51.11%；～20mg/L 10例，～40mg/L 4例，CRP>40mg/L 8例；ASO 42例正常，3例轻度增高；（4）肝功能ALT和（或）AST升高4例；心肌酶谱CK及CK-MB升高3例。

2.3 45例突变MP所致肺炎的肺外合并症

本文45例基因突变MPP中20例有肺外合并症，占44.4%；其中渗出性胸膜炎6例，均为4岁以上患儿；血液系统受累表现为轻度贫血3例；血小板增多6例；消化系统受累表现为恶心，呕吐，腹痛2例；肝功能ALT和（或）AST升高4例；中枢神经系统受累3例，表现为精神状态差，嗜睡，脑电图显示双半球θ频带功率增高；心血管系统：心肌酶谱CK及CK-MB升高3例；皮肤受累4例，表现为荨麻疹或斑丘疹；泌尿系统受累1例，表现为镜下尿蛋白阳性，红细胞及白细胞增多，无尿频、尿急、尿痛等症状；结膜炎2例；所有肺外合并症给予相应治疗及对症处理后均恢复正常。

2.4 治疗与转归

45例患儿中有30例（66.7%）在入院前应用口服或静点大环内酯类抗生素治疗，平均用药5.27d。入院后 45例均给予静滴红霉素，30mg·kg-1·d-1，疗程 7～16d，平均住院时间（11.87+3.14）d；恢复期及出院后给予口服阿奇霉素1～2个疗程序贯治疗；10例肺部有喘鸣音者给予支气管扩张剂及糖皮质激素吸入治疗；合并其他感染者，同时选用相应敏感药物治疗。共治愈36例，好转5例无效4例，有效率：91.1%。无效4例：均为年长儿，影像学检查提示肺部大叶实变炎症，2例伴胸腔积液，应用大环内酯类药物治疗5～7d后，发热无下降趋势，炎症无吸收或范围增大，予静点甲强龙（1～2mg·kg-1·d-1）或/和丙种球蛋白（300～400mg·kg-1·d-1）治疗 3d，患儿在治疗后1～3d发热逐渐消退，总热程平均12.75d，平均住院13.5d。其中3例临床症状均消失，肺CT提示炎症较前吸收或好转出院，1例患儿静点甲强龙及丙种球蛋白3d后仍有低热，复查胸片显示炎症较前吸收，退院。

3 讨论

MP感染在全球范围内均有发生，是各年龄段儿童急性上、下呼吸道感染的常见病原体之一［8］。本病发病年龄多为学龄儿童，本文统计各年龄段人数构成比无明显差异，考虑可能与年长儿住院率较低、样本量较小等因素有关。肺炎支原体肺炎多表现为持续性发热伴刺激性干咳，本文患儿91.1%有此症状，早期查体多无阳性体征。表2可见患儿多表现为中高度热，与国内辛德莉等［9］报道基本相符。由表1、2可见无热、低热及热程较短的患儿均为3岁以内婴幼儿，考虑与肺炎支原体对年幼儿的免疫损伤较弱有关［10］。本文统计患儿平均在发病后8.75d住院，行胸部X线或CT检查均发现不同程度的肺部炎性改变，多数表现为沿肺纹理走形模糊斑片影，7例表现为大叶性肺炎，占15.55%。患儿早期体征多不明显，故应早期行X线检查［11］。肺部闻及喘鸣音者18例，占40%，其中8例既往有喘息病史，10例为首次出现喘息。有文献报道，MP是仅次于病毒引起患儿喘息反复发作的病原，且急性MP感染能诱发无症状患者哮喘的首次发作［12］。

随着肺炎支原体肺炎发病率的上升，其肺外合并症也逐渐增多，且全身各系统均可受累［13］。本文肺外合并症20例，占44.44%。主要表现为肝功能异常、心肌受累、尿常规异常、皮疹、贫血，渗出性胸膜炎和眼结膜炎等，MP对肺外各系统的的致病机制尚不十分清楚，但主要倾向于免疫因素［14］。

目前儿童MP肺炎的治疗主要选择大环内酯类抗生素。然而近几年来，世界各国不断报道临床患儿分离出MP，体外药敏试验证实为耐药，基因测序发现主要为MP23SrRNA的2063或/和2064位发生点突变，且各个国家及地区所报道的突变比率差异较大。法国［4］自1994－2006年连续12年的一项监测报道，155例临床分离株中有2株突变。美国［5］最近一项研究显示，100株临床分离株中有5株突变。德国Dumke等［6］报道2003-2008年167例临床标本中也仅有2株突变。然而，日本2000-2006年研究显示肺炎支原体突变率已从0（0/47）上升至30．6%（37/121）。本文45例均存在23SrRNA的2063位点的点突变，突变率达100%。与我国上海地区［3］同期报道一致。辛德莉等［15］（2009）报道北京地区突变率已达92%。

研究表明大环内酯类抗生素的耐药机制主要是（1）靶位改变：基因突变或甲基化；（2）主动外排；（3）药物灭活［16］；而 MP23SrRNA2063或 2064位点基因突变，是MP对大环内酯类抗生素主要的耐药机制。目前对突变MP在体外对抗生素的药敏试验耐药的结果与临床疗效关系的报道不多。据Suzuki等［17］报道，用大环内酯类抗生素治疗肺炎支原体肺炎，MP耐药株与敏感株所致肺炎相比，总的发热时间约长3d以上，但是没有出现大环内酯类抗生素治疗失败或病情加重的情况。本研究中未发现敏感株，但本文统计突变株所致总的平均发热时间较Suzuki等［17］报道的敏感株明显延长。另一文献［1］报道，耐药MP所致社区获得性肺炎患儿中，由于持续发热、咳嗽或胸部影像学提示炎症无吸收或加重，应该用米诺环素或左氧氟沙星替代大环内酯类抗生素。尽管如此，从安全性方面来看，儿童仍不主张应用氟喹诺酮类及四环素类抗生素。本研究45例23SrRNA中均存在2063位A→G的点突变，其中2例为2063位点A/G双峰，均采用大环内酯类药物治疗，45例患儿的临床表现虽轻重不一，但应用大环内酯类抗生素治疗，有效率达91.1%，对4例无效患儿，予加用甲强龙（1～2mg·kg-1·d-1）或/和丙种球蛋白（300～400mg·kg-1·d-1）治疗 3d，1～3d 后肺部症状、体征明显好转，疗效显著。此4例用红霉素治疗无效的患儿，考虑为年长儿肺炎支原体感染后与机体的过度炎性反应或免疫损伤机制有关，加用激素或丙种球蛋白可抑制过强的炎症反应，使这种免疫损伤减轻［10］。耐药不会导致严重的临床表现。因为肺炎支原体感染破坏免疫调节，可引起过强的炎性反应。由于本研究无大环内酯类敏感的23SrRNA非变异组的对照研究，因此肺炎支原体此位点突变与在体内是否耐药的关系有待于进一步研究。

总之，MP突变株的产生应引起临床医师的高度重视。目前对于体外药敏实验及分子学改变证实的MP对大环内酯类耐药的临床意义尚不十分明确，对其所致肺炎的临床表现尚无特异性，且应用大环内酯类抗生素治疗绝大部分有效。临床上又不能进行前瞻性的大规模人群的随机试验来研究大环内酯类耐药与临床疗效的关系，因此有必要通过复制感染动物模型来研究各个危险因素对临床疗效的影响，比较大环内酯类药物治疗敏感及耐药MP感染的疗效，从而提高对体外耐药MP所致肺炎的认识及诊治水平，为临床上合理应用抗生素提供参考，为新药研发提供理论依据。

［1］Morozumi M，Iwata S，Hasegawa K，et al.Increased macrolide resistance of mycoplasma pneumoniae in pediatric patients with community-acquired pneumonia［J］.Anti Age Chemo，2008，52（1）：348-350.

［2］辛德莉，糜祖煌，韩旭，等.应用巢式聚合酶链反应和测序检测肺炎支原体 23SrRNA 中点突变［J］. 中华儿科杂志，2008，46（7）：522-525.

［3］Yang Liu，Xinyu Ye，Hong Zhang，et al.Antimicrobial susceptibility of mycoplasma pneumoniae isolates and molecular analysis of macrolide-resistant strains from shanghai，China ［J］.Anti Age Chemo，2009，53（5）：2160-2162．

［4］Pereyre S，Charron A，Renaudin H，et al.First report of macrolide-resistant strains and description of a novel nucleotide sequence variation in the P1adhesin gene in mycoplasma pneumoniae clinical strains isolated in france over 12years［J］.J Clin Microbiol，2007，45（11）：3534-3539.

［5］ Bernard J，Wolff W，Thacker L，et al.Detection of macrolide resistence in mycoplasma pneumoniae by real-time PCR and high-resolution melt analysis［J］.Anti Age Chemo，2008，52（10）：3542-3549.

［6］Dumke R，von Baum H，Lück PC，et al.Occurrence of macrolideresistant Mycoplasma pneumoniae strains in Germany［J］.Clin Microbiol Infect，2010，16（6）：613-616.

［7］胡亚美，江载芳．诸福棠实用儿科学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1177-1178．

［8］Xiao li，Atkinson P，Hagood J，et al.Emerging macrolide resistence in mycoplasma pneumoniae in children ［J］.Pediatr Infect Dis J，2009，28（8）：693-696.

［9］张忠浩，辛德莉，刘禧杰，等.耐红霉素肺炎支原体肺炎24例临床分析［J］.中国实用儿科杂志，2008，23（12）：927-929.

［10］Kamizono S，Ohya H，Higuchi S，et al.Three familial cases of drugresistant Mycoplasma pneumoniae infection ［J］.Eur J Pediatr，2010，169（6）：721-726.

［11］袁壮，董宗祈，胡仪吉，等．小儿肺炎支原体感染诊断治疗中的几个问题［J］．中国实用儿科杂志，2002，17（8）：449-457.

［12］Chang YT，Yang YH，Chiang BL.The significance of a rapid cold he-magglutination test for detecting mycoplasma infections in children with asthma exacerbation J［J］.J Microbiol Immunol Infect，2006，39（1）：28-32.

［13］徐慧香，张慧燕，车大钿．小儿肺炎支原体肺炎106例临床分析［J］．中国实用儿科杂志，2007，22（1）：52．

［14］Mamessier E，Botturi K，Verloet D，et a1．T regulatory lymphocytes，atopy and asthma：a new concept in three dimensions［J］．Rev Mal Respir，2005，22（2）：305-311．

［15］Xin D，Mi Z，Han X，et a1．Molecular mechanisms of macrolide resistance in clinical isolates of Mycoplasma pneumoniae from China［J］．Anti Age Chemo，2009，53（5）：2158-2159．

［16］韩旭，辛德莉．MP对大环内酯类抗生素的耐药机制［J］．实用儿科临床杂志，2006，21（16）：1101-1103．

［17］SuzukiS，YamazakiT，NaritaM，etal.ClinicalEvaluationof Macrolide-Resistant Mycoplasma pneumoniae［J］.Anti Age Chemo，2006，50（2）：709-712．

（编辑裘孝琦，英文编辑王又冬）

Mutations of Mycoplasma Pneumoniae23SrRNAGene and Clinical Evaluation of Mutational Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia

HAN Xiao-hua，LU Su-kun，LI Shu-xiu，LIU Li-yun，CHEN Ning，LI Shu-qin
（Department of Respiration Pediatrics，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo study the mutations of the23SrRNAgene of Mycoplasma pneumoniae（MP）and improve the recognition of the clinical situation and therapy of patients infected with it.MethodsPharynx specimens from 180inpatients with Mycoplasma pneumoniae pneumonia （MPP）from May to October of 2009.MP-23SrRNAgene was amplified by nested PCR and DNA sequencing was performed.Then we screened the mutational MP.The characteristics of the inpatients diagnosed with mutational MP pneumonia were analyzed and summarized．Results23SrRNAgene was found in 45patients by nested PCR and DNA sequencing.All had A to G mutation at position 2063，in which 2showed the coexistence of A and G.91.1%of the patients showed continuous fever accompanied by irritating cough；68.9%had normal peripheral blood white blood cell counts.Lung CT or X-ray image of the 45patients showed inflammation：14cases showed effusion or cloudy floc shadow in bilateral lungs；7showed lobar pneumonia，and 6developed exudative pleurisy.20cases had complications outside the lungs.All the patients were treated with erythromycin，and the effective rate was 91.1%．ConclusionThe 2063point mutation of23SrRNAgene is commomn in MPP patients，and the clinical manifestation is diverse.But the macrolides is effective for the treatment of the MPP patients.The relationship between point mutation in23SrRNAat position 2063and macrolide-resistant in vivo need further research.

Mycoplasma pneumoniae pneumonia；23SrRNAgene mutation；clinical manifestation；drug resistance

R563.1

A

0258-4646（2011）02-0162-05

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0954.017

韩晓华（1962-），女，主任医师，硕士.E-mail：hanxh5519@163.com

2010-11-12