血管内皮生长因子调节成骨细胞中Ihh和p38MAPK的表达

赵恒伍，张锦程，李长有

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）

血管内皮生长因子调节成骨细胞中Ihh和p38MAPK的表达

赵恒伍，张锦程，李长有

（中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001）

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）对大鼠成骨细胞Ihh和p38MAPK的调节作用。方法 取胎鼠颅盖骨分离培养成骨细胞，采用实时PCR检测成骨细胞中Ihh及其受体Ptch1和p38MAPK的表达，检测成骨细胞在不同浓度（0，2，20ng/ml）及不同时间（0，12，24h）的VEGF作用下Ihh和p38MAPK的表达情况。结果 成骨细胞表达Ihh及其受体Ptch1，同时表达p38MAPK。随着VEGF浓度的增加，Ihh和p38MAPK的表达量均明显增加；随着VEGF作用时间的增加，Ihh和p38MAPK的表达量与对照组相比有明显的增长趋势。结论Ihh与其受体Ptch1在成骨细胞中共表达，Ihh以自分泌方式调节成骨细胞功能；VEGF上调成骨细胞中Ihh和p38MAPK的表达，并且VEGF可能通过调节p38MAPK的表达而影响Ihh的表达，可能存在VEGF-p38MAPK-Ihh通路。

成骨细胞；大鼠；Ihh；血管内皮生长因子

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为血源性因子具有调节成骨细胞的功能。Hedgehog（Hh）蛋白家族包括3个成员：Sonic Hedgehog（Shh）、Indian Hedgehog（Ihh） 和 Dersert Hedgehog（Dhh）。其中，Shh和Ihh作为重要的信号分子，在肢体发育过程中起关键调控作用。研究发现，Ihh影响成骨细胞的发育［1］。p38丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路在成骨细胞增殖、分化中有重要意义［2］。本研究对VEGF是否可以调节成骨细胞中Ihh和p38MAPK的表达进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：新生SD大鼠胎鼠，清洁级，由中国医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 药品和试剂：鼠重组VEGF蛋白（美国Pepro－Tech公司），α-MEM培养基（美国Gibco公司），I型胶原酶（美国Sigma公司），碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建成生物工程研究所），茜素红（中国医科大学解剖教研室惠赠），Trizol、实时PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），PCR引物由TaKaRa公司合成。

1.2 方法

1.2.1 成骨细胞培养：出生24h内的大鼠，切下颅盖骨，用剪刀将骨组织剪碎，0.5%Ⅰ型胶原酶5ml 37℃预消化20min，弃消化液，0.5%Ⅱ型胶原酶5ml 37℃消化20min，移取消化液，将骨片再次0.5%Ⅱ型胶原酶5ml 37℃消化20min，移取消化液，如此反复4次，将移取的消化液1000r/min离心10min，弃上清，加入培养液适量；混匀消化的细胞，以1.2×104/cm2接种于 25cm2培养瓶，置 5%CO2、37℃条件下培养。

1.2.2 实验分组：第4代成骨细胞达80%融合时，用含1%胎牛血清的α-MEM培养基同步化后随机分为：（1）正常对照组：只加1%胎牛血清的α-MEM培养；（2）VEGF 组：不同浓度（0，2，20ng/ml）及不同时间（0，12，24h）的 VEGF 培养。

1.2.3 实时PCR检测IhhmRNA、Ptch1mRNA和p38MAPKmRNA的表达：Trizol提取总细胞RNA，逆转录合成cDNA。Ihh上游引物为5′-TGCCTCCGT CCTCTGCT-3′，下游引物为 5′-CACTACCTGGTCAA GTCTCAAA-3′；Ptch1上游引物为 5′-TCCTGATTGC GTCTGTTG-3′，下游引物为 5′-AGCCCTGTGGTTCT TGTC-3′；p38MAPK 上游引物为 5′-AGACCGTTTCA GTCCATCA-3′，下游引物为 5′-TCACATTCTCGTGC TTCAT-3′；内参照 GAPDH，上游引物为 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物为 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。PCR 反应条件为 95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，45个循环。反应结束后，采用PCR仪（Gene 6000）软件进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 成骨细胞培养鉴定

成骨细胞在生长过程中表现出均一的短梭形或三角形，培养一段时间后细胞呈铺路石样改变，经ALP染色胞质呈黑紫色（图1A，B）。含β硝酸甘油的培养基培养2周，可见钙结节形成，经茜素红染色呈砖红色结节（图1C）。

2.2 成骨细胞中Ihh、Ptch1和p38MAPKmRNA的表达

PCR结果显示，成骨细胞中Ihh及其受体Ptch1mRNA清晰表达，p38MAPKmRNA也清晰表达（图2）。

2.3 VEGF调节成骨细胞中Ihh和p38MAPKmRNA的表达

在不同浓度（0，2，20ng/ml）VEGF 作用下，Ihh和p38MAPKmRNA的表达量均随VEGF浓度的增加而增多，在20ng/ml VEGF作用下Ihh和p38MAPKmRNA的表达量分别约为无VEGF作用时的2.6倍（图3A）和4.7倍（图3B）；在同一剂量（20ng/ml）VEGF的作用下，Ihh和p38MAPKmRNA的表达量随作用时间的延长而增多，在24h时Ihh和p38MAPKmRNA的表达量分别约为0h的2.8倍（图4A）和 2.9倍（图 4B）；无 VEGF作用时，Ihh和 p38MAPKmRNA的表达量随时间延长均无明显变化（图4）。

3 讨论

Ihh是一种分泌型蛋白，属于Hedgehog信号家族，是果蝇节段性极性基因Hedgehog在脊椎动物体内的同源物，主要表达于哺乳动物肥大软骨细胞，与胚胎发育过程中骨骼的形成密切相关。Ptch1是Ihh信号通路受体细胞上的受体蛋白及下游目标基因，为一类12通道的跨膜蛋白，当Ihh蛋白与Ptch1结合后，诱导一系列下游信号分子的释放，发挥其调控作用［3］。本研究发现，成骨细胞中Ihh及其受体Ptch1同时表达。近年研究发现Ihh参与调节胚胎发育的软骨内成骨过程，其主要作用是影响软骨细胞的终末分化，调节成骨细胞分化［4］。体外实验证实，Ihh可促进成骨细胞分化。干预Ihh信号（Ihh缺如、抑制Ihh受体Ptch1）发现，鼠的骨领和初级骨小梁都未形成［5，6］。这些都说明了Ihh与其受体Ptch1结合调节成骨细胞功能。本研究证实Ihh及其受体Ptch1可在成骨细胞合成，通过自分泌方式调节成骨细胞功能。

MAPK属丝氨酸苏氨酸激酶，是一类分布于胞质中具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化能力的蛋白激酶。MAPK信号转导途径是细胞外信号引起细胞核内反应的通道之一，可参与细胞的形成、运动、凋亡、分化及生长增殖等多种生理过程［7］。p38MAPK途径是MAPK信号转导途径的通道之一，是成骨细胞增殖分化调节的重要信号通路之一［8］。本研究也证实了p38MAPK在成骨细胞是有表达的。

本研究还证实，VEGF促进成骨细胞中Ihh的表达，同时也可促进p38MAPK的表达。VEGF作用下，Ihh和p38MAPK的表达量与VEGF存在剂量依赖性和时间依赖性；随着VEGF剂量加大、VEGF作用时间的延长，Ihh和p38MAPK的表达量增加。Kim等［9］在成骨样细胞的研究中发现，VEGF对p38MAPK有调节作用，这与我们研究的结果一致。但关于VEGF是否具有调节Ihh作用的文献报道很少。Li等［10］发现，骨髓间充质干细胞中Ihh的表达通过p38MAPK途径，p38MAPK的表达增加可促进Ihh的表达增加。由此推断，成骨细胞中VEGF可能通过促进p38MAPK的表达促进Ihh的表达。本研究证实，VEGF可促进Ihh的表达，VEGF作用下p38MAPK的表达与Ihh的表达有相关性。通过本研究发现，VEGF可调节p38MAPK和Ihh，提示可能存在VEGF-p38MAPK-Ihh调节通路。

［1］Kesper DA，Didt-Koziel L，Vortkamp A.Gli2activator function in preosteoblasts is sufficient to mediate Ihh-dependent ssteoblast differentiation，whereas the repressor function of Gli2is dispensable for endochondral ossification［J］.Dev Dyn，2010，239（6）：1818-1826.

［2］Parreno J，Hart DA.Molecular and mechano-biology of collagen gel contraction mediated by human MG-63cells：involvement of specific intracellular signaling pathways and the cytoskeleton ［J］.Biochem Cell Biol，2009，87（6）：895-904.

［3］Zunich SM，Douglas T，Valdovinos M，et al.Paracrine sonic hedgehog signalling by prostate cancer cells induces osteoblast differentiation［J］.Mol Cancer，2009，2（8）：1-12.

［4］Burdan F，Szumixo J，Korobowicz A，et al.Morphology and physiology of the epiphyseal growth plate ［J］.Folia Histochem Cytobiol，2009，47（1）：5-16.

［5］Guo S，Zhou J，Gao B，et al.Missense mutations in Ihh impair Indian Hedgehog signaling in C3H10T1/2cells：implications for brachydactyly type A1，and new targets for Hedgehog signaling［J］.Cell Mol Biol Lett，2010，15（1）：153-176.

［6］Ruiz-Perez VL，Blair HJ，Rodriguez-Andres ME，et al.Evc is a positive mediator of Ihh-regulated bone growth that localises at the base of chondrocyte cilia［J］.Development，2007，134（16）：2903-2912.

［7］Séverin S，Ghevaert C，Mazharian A.The mitogen-activated protein kinase signaling pathways：role in megakaryocyte differentiation［J］.J Thromb Haemost，2010，8（1）：17-26.

［8］Gaundar SS，Bendall LJ.The potential and limitations of p38MAPK as a drug target for the treatment of hematological malignancies［J］.Curr Drug Targets，2010，11（7）：823-833.

［9］Kim IS，Song JK，Song YM，et al.Novel effect of biphasic electric current on in vitro osteogenesis and cytokine production in human mesenchymal stromal cells［J］.Tissue Eng Part A，2009，15（9）：2411-2422.

［10］LiJ，ZhaoZ，YangJ，etal.p38MAPKmediatedincompressive stressinduced chondrogenesis of rat bone marrow MSCs in 3D alginate scaffolds［J］.Cell Physiol，2009，221（3）：609-617.

（编辑陈 姜，英文编辑王又冬）

Effect of Vascular Endothelial Growth Factor on the Expressions ofIhhandp38MARKin Osteoblasts

ZHAO Heng-wu，ZHANG Jin-cheng，LI Chang-you
（Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effect of vascular endothelial growth factor （VEGF）on the expressions of Indian hedgehog（Ihh）and p38mitogen-activated protein kinase （MAPK）in osteoblasts.MethodsThe osteoblasts from the calvarial of neonatal rats were cultured and treated with different concentrations （0，2，and 20ng/ml）of VEGF for various durations （0，12，and 24hours）.The expressions levels ofIhhand its receptorPtch1andp38MAPKin the osteoblasts were determined with real-time polymerase chain reaction.ResultsIhh，Ptch1，andp38MAPKexpression were observed in the osteoblasts.With the increase of the concentration of VEGF，the expressions levels ofIhhandp38MAPKsignificantly increased.Compared with control group，the expresions ofIhhandp38MAPKtended to increase with the prolongation of the duration of VEGF treatemnt.ConclusionIhhandPtch1were coexpressed in the osteoblasts.Ihhregulates the osteoblasts in an autocrine manner.VEGF might upregulates the expressions ofIhhby regulatingp38MAPKexpression.VEGF-p38MAPK-Ihh pathway might exist in the osteoblasts.

osteoblast；rat；indian hedgehog；vascular endothelial growth factor

R593.22

A

0258-4646（2011）02-0113-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0950.004

辽宁省自然科学基金资助项目（20092119）

赵恒伍（1985-），男，硕士研究生.

李长有，E-mail：cyli@mail.cmu.edu.cn

2010-11-23