自发性2型糖尿病动物模型KKAy小鼠肾脏损害的特征与演变

刘晓丹，杨刚，范秋灵，刘楠，栗霄立，冯江敏

（中国医科大学附属第一医院肾内科，沈阳110001）

自发性2型糖尿病动物模型KKAy小鼠肾脏损害的特征与演变

刘晓丹，杨刚，范秋灵，刘楠，栗霄立，冯江敏

（中国医科大学附属第一医院肾内科，沈阳110001）

目的观察自发性2型糖尿病动物模型KKAy小鼠糖尿病早期肾损害的特征和演变，旨在探讨其在糖尿病肾病研究中的应用价值。方法 选择8周龄雄性KKAy小鼠和C57BL/6小鼠各20只，分别于8周龄、20周龄测定血糖、尿微量白蛋白、尿肌酐，并留取肾脏标本，于光镜及电镜下观察其肾脏病理特点。结果 不同周龄KKAy小鼠体质量、随机血糖均高于对照组C57BL/6小鼠（P<0.05）。20周龄KKAy小鼠尿白蛋白排泄率显著高于8周龄KKAy小鼠和对照组C57BL/6小鼠（P<0.05）。20周龄KKAy小鼠光镜下肾小球面积增大，肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜基质增生，可见硬化结节；电镜下肾小球基底膜增厚，足突部分扁平、融合。结论20周龄KKAy小鼠出现肥胖、高血糖、尿白蛋白排泄率增加及典型的糖尿病肾病病理改变，是研究2型糖尿病早期肾损害的理想动物模型。

KKAy小鼠；糖尿病肾病；动物模型；肾脏病理损害

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见、最严重的并发症。糖尿病肾病发病隐匿，早期以微量蛋白尿为唯一表现，如未早期发现及控制，持续进展将形成大量蛋白尿，最终引起肾功能不全，给患者和社会带来巨大的医疗压力和沉重的经济负担［1］。人源标本的不足、遗传背景的复杂性和不可控性是长期以来困扰人类疾病研究的难题。以模型动物代替人体实验是解决这一问题的常用方法，动物模型与人类疾病的相似程度是判断该模型的重要指标［2］。自发性2型糖尿病动物模型KKAy小鼠以其更接近人类2型糖尿病肾病早期病变的特点，正逐步引起人们的关注。本文观察自发性2型糖尿病KKAy小鼠肾脏损害的特征和演变，以证实该动物模型在糖尿病肾病早期病变研究方面的价值。

1 材料与方法

1.1 动物的分组及处理

SPF级雄性8周龄KKAy小鼠20只，购自中国医学科学院实验动物研究所，许可证号：SCXK（京）2005-0013；SPF级雄性8周龄C57BL/6小鼠20只，购自中国医科大学实验动物部，许可证号：SCXK（辽）2008-0005。饲养于中国医科大学实验动物部SPF级动物房，单笼饲养，温度（23±3）℃，湿度50%±20%，每12h交替照明。KKAy小鼠给予高脂饮食（购自中国医学科学院实验动物研究所）；C57BL/6小鼠给予普通饲料。所有小鼠均自由进食、饮水。

1.2 方法

1.2.1 体质量：于8、12、16、20周龄应用电子台秤测定小鼠体质量。

1.2.2 随机血糖检测：于8、12、16、20周龄尾静脉取血测血糖（德国罗氏乐康全血糖仪及试纸），随机血糖≥13.9mmol/L确诊为糖尿病。

1.2.3 尿微量白蛋白、尿肌酐检测：于8周龄、20周龄采用提尾反射法收集KKAy小鼠和C57BL/6小鼠随机尿液，采用ELASA试剂盒（购于美国RB公司）检测尿微量白蛋白和尿肌酐，计算尿微量白蛋白/肌酐比率。

1.2.4 肾脏形态学观察：分别于8周龄、20周龄处死小鼠后，立即留取肾脏皮质，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，行HE染色，PAS染色，光学显微镜下观察病理变化。留取肾脏标本2.5%戊二醛中固定，透射电镜下观察肾脏超微结构的变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 体质量的变化

随着年龄的增长，KKAy小鼠和C57BL/6小鼠的体质量均逐渐增加，KKAy小鼠8、12、20周龄的体质量为（25.44±0.79）g、（36.37±1.1）g、（45.92±2.61）g，正常对照组C57BL/6小鼠的体质量为（20.81±2.07）g、（24.68±1.67）g、（30.47±1.34）g。两组间相应周龄的体质量差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2 血糖的变化

KKAy小鼠于8、20周龄的平均随机血糖为（19.94±5.34）mmol/L、（29.62±3.99）mmol/L，相应周龄 C57BL/6小鼠平均随机血糖为（10.65±1.40）mmol/L、（11.07±1.26）mmol/L。两组间相应周龄的随机血糖差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.3 尿微量白蛋白/肌酐检测结果

随着年龄的增长，KKAy小鼠的尿微量白蛋白/肌酐比率逐渐增加。KKAy小鼠于8、20周龄的尿微量白蛋白/肌酐比率分别为（41.85±4.81）mg/g、（728±177.19）mg/g，相对应周龄的C57BL/6小鼠的尿微量白蛋白/肌酐比率分别为（46.91±5.14）mg/g、（49.37±18.77）mg/g。20周龄 KKAy小鼠，尿微量蛋白/肌酐比率显著高于8周龄KKAy小鼠和对照组C57BL/6小鼠（P<0.05）。

2.4 肾脏病理改变

20周龄KKAy小鼠肾脏体积增大，表面尚光滑，均可见肾盂扩张；20周龄对照组C57BL/6小鼠肾脏红润光滑，无肾盂扩张。光镜下可见，8周龄、20周龄KKAy小鼠的肾小球面积均大于相应周龄对照组；20周龄KKAy小鼠肾小球基底膜增厚，系膜基质增生，可见硬化结节，肾小管基底膜增厚（见图1、2）。电镜下可见8周龄KKAy小鼠肾脏结构基本正常；20周龄KKAy小鼠肾小球基底膜增厚，足突部分扁平、融合（图 3，4）。

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症，已经引起了普遍关注。其发病可能与遗传易感性、糖脂代谢紊乱以及肾小球血流动力学改变等因素有关。糖尿病肾病发病隐匿，早期诊断及治疗对于逆转疾病的进程至关重要，建立与人类2型糖尿病肾病早期病理改变相似的动物模型是深化研究的基础［3］。

目前小剂量链脲佐菌素（streptozocin，STZ）注射结合高糖高脂饮食所诱发的2型糖尿病肾病动物模型，因其操作相对简易，实验成本较低，在研究中应用较多［4～7］。但是给药剂量及饮食干预的不一致性及药物本身对肾脏的损伤，均对疾病研究的准确性及连续性带来了干扰。转基因糖尿病肾病动物模型，其转入致病基因明确，动物模型遗传背景清楚，且接近人类糖尿病肾病临床表型，为其应用优势所在。但由于其对技术及操作水平的较高要求，目前应用仍受到一定的限制。相对上述两类动物模型而言，自发性动物模型具有遗传信息完整，个体差异小，繁育时间短及实验重复性好等优点［8］。KK小鼠系能自发出现肥胖、高血糖及高胰岛素血症［9］。其编码皮毛颜色信息的Agouti（a）基因位于小鼠2号染色体上，该基因为a/a纯合子时，小鼠皮毛表达正常的黑色，当出现黄色基因（yellow，y）变异为Ay/a杂合子时，小鼠皮毛呈现黄色，同时伴发肥胖、高血糖、脂质代谢紊乱等代谢异常综合征［10］。遗传因素和环境因素共同参与了KKAy小鼠糖尿病的发生，与人类2型糖尿病极其相似［11］。

本研究观察到，以随机血糖≥13.9mmol/L作为小鼠糖尿病诊断标准，大部分KKAy小鼠于8周龄发生糖尿病，但尿微量白蛋白排泄水平正常，肾脏结构基本正常，尚未发生肾脏损害。20周龄时，血糖进一步升高，体质量明显高于对照组，随机尿液中尿微量白蛋白排泄水平与尿肌酐的比率（反映24h尿白蛋白排泄水平）显著高于对照组，与本课题组［12］关于KK系KK/Ta小鼠的研究结果相近。病理研究发现，20周龄KKAy小鼠光镜下可见肾小球基底膜增厚，系膜基质增生，伴硬化结节，电镜下可见肾小球基底膜增厚，足突部分扁平、融合，符合糖尿病肾病早期典型的病理改变，此观察结果与陈丽萌等［13］相关研究结果一致。

综上所述，自发性2型糖尿病动物模型KKAy小鼠，8周龄时血糖水平显著升高，20周龄时尿白蛋白排泄量显著增加，肾脏病理改变与人类糖尿病肾病相似，是研究2型糖尿病早期肾脏损害的理想动物模型。

［1］Atkins RC，Zimmet P.Diabetic kidney disease：act now or pay later［J］.Kidney Int，2010，77（5）：375-377.

［2］Leiter EH.Selecting the‘right’mouse model for metabolic syndrome and type 2diabetes research［J］.Methods Mol Biol，2009，560：1-17.

［3］Baribault H.Mouse models of typeⅡdiabetes mellitus in drug discovery［J］.Methods Mol Biol，2010，602：135-155.

［4］张浩军，赵静波，李平.糖尿病肾病动物模型研究进展［J］.中国药理学通报，2008，24（7）：845-848.

［5］赵保胜，董淑云，霍海如，等.2型糖尿病动物模型的研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2005，11（5）：62-66.

［6］田爱平，郭赛珊，陈跃腾，等.高热量饲料诱发胰岛素抵抗动物模型的实验研究［J］.中国药学杂志，2006，41（11）：827-831.

［7］黄桂红，贺敏，黄仁彬.链脲佐菌素致糖尿病小鼠模型的建立及抗氧化能力的影响［J］.中国药事，2009，23（8）：755-757.

［8］万玉玲，刘晓明.自发性2型糖尿病动物模型［J］.医学综述，2008，14（14）：2175-2177.

［9］陈其明，史顺娣，申竹芳，等.糖尿病KK小鼠生物特性的研究［J］.中国医学科学院学报，1988，10（6）：416-420.

［10］Bazhan NM，Makarova EN.The effect of the ‘yellow’mutation at the mouse agouti locus on the hormonal profile of pregnancy and lactation ［J］.Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova，2009，95（11）：1254-1257.

［11］郭清华，陆菊明，潘长玉.饮食能量对Kkay及Kk小鼠2型糖尿病发病的影响［J］.军医进修学院学报，2005，26（2）：140-142.

［12］Fan QL，Shike T，Shigihara T，et al.Gene expression profile in diabetic KK/Ta mice［J］.Kidney Int，2003，64（6）：1978-1985.

［13］陈丽萌，李学旺，黄利伟，等.2型糖尿病小鼠（KKAy）动物模型的鉴定和早期肾脏病理改变［J］.中国医学科学院学报，2002，24（1）：71-75.

（编辑裘孝琦，英文编辑王又冬）

Renal Impairment in KKAy Mice with Spontaneous Type 2Diabetes

LIU Xiao-dan，YANG Gang，FAN Qiu-ling，LIU Nan，LI Xiao-li，FENG Jiang-min
（Department of Nephrology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the early renal impairment in KKAy mice with spontaneous type 2diabetes.MethodsBlood glucose，urinary microalbumin and urinary creatinine of twenty male KKAy mice and twenty male C57BL/6mice were measured at the age of 8，20weeks respectively.The renal pathological changes were observed under light microscope and electron microscope.ResultsKKAy mice developed higher body weight and blood glucose than C57BL/6mice at all the different ages （P<0.05）.Urinary microalbumin/creatinine ratio in 20-week-age KKAy mice was higher than that in 8-week-age KKAy mice and C57BL/6mice （P<0.05）.Pathological lesions in 20-week-age KKAy mice were increasing of glomerular area，thickening of glomerular basement membrane，expansion of mesangial matrix，with sclerosis lesions under light microscope；thickening of basement membrane and fusion of foot processes were evident under electron microscope.ConclusionKKAy mice developed obesity，hyperglycemia，albuminuria and typical pathological lesions of diabetic nephropathy at 20weeks of age.Therefore，KKAy mice may serve as a suitable model for the study of type 2diabetes and early stage diabetic nephropathy in humans.

KKAy mice；diabetic nephropathy；animal model；renal pathological lesions

R587.2

A

0258-4646（2011）02-0104-03

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0949.001

国家自然科学基金资助项目（30700369）；留学回国人员科研启动基金资助项目（教外司留［2006］331号）；辽宁省教育厅高校科研计划项目（L2010658）

刘晓丹（1977-），女，主治医师，博士研究生.

范秋灵，E-mail：cmufql@163.com

2010-11-06