应用组织芯片技术检测胃肠道间质瘤中MMP-2，MMP-9的表达及与临床病理行为的关系

赵滢，张天彪，王强

（中国医科大学1.附属盛京医院胃肠营养外科，沈阳 110004；2.基础医学院生物化学与分子生物学教研室，沈阳 110001）

应用组织芯片技术检测胃肠道间质瘤中MMP-2，MMP-9的表达及与临床病理行为的关系

赵滢1，张天彪2，王强1

（中国医科大学1.附属盛京医院胃肠营养外科，沈阳 110004；2.基础医学院生物化学与分子生物学教研室，沈阳 110001）

目的检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在GIST中的表达及其与临床病理行为的关系。方法 收集124例GIST标本，用组织芯片和免疫组织化学法检测MMP-2，MMP-9表达。结果 在124例GIST中，MMP-2阳性表达81例（65.3%）；MMP-9阳性表达74例（59.7%）；其表达与GIST侵袭转移、NIH分级、黏膜受侵有相关性，二者之间呈正相关（r=0.716，P＜0.05）。结论MMP-2，MMP-9在GIST组织中高表达，这为揭示GIST的发生发展提供了新的理论依据。

胃肠道间质瘤；组织芯片；免疫组化；MMP-2；MMP-9

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）的侵袭和转移是一个多步骤、多种成分参与的连续过程，在此过程中，肿瘤组织对基底膜和细胞外基质的降解是肿瘤细胞能否形成转移的关键步骤，目前研究认为基质金属蛋白酶系统（matrix metallo proteinse，MMPs）是参与此过程的最重要的酶系统［1］。

基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）与 GIST 浸润和转移关系密切［2］。本研究通过构建GIST组织芯片，应用免疫组织化学方法，检测MMP-2和MMP-9的表达，探讨两者相关性，及其与GIST临床病理行为的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

选择临床病理资料完整的中国医科大学附属盛京医院1993年9月～2010年2月手术切除、病理证实的GIST新鲜组织标本124例。男性64例、女性60例，年龄9～79岁、平均54.6岁。肿瘤发生于胃62例（50.0%）、小肠28例（22.6%）、结直肠14例（11.3%）、食管 9例（7.3%）、胃肠道外 11例（8.9%）（其中网膜4例、肠系膜4例、后腹膜3例）。

GIST的诊断标准：常规形态符合GIST诊断要点。依据Fletcher等［3］提出的GIST生物学行为分级标准进行分级（NIH分级）。另取肿瘤旁组织作为对照。

1.2 组织芯片的制备

组织芯片的制作利用陕西超英生物公司病理研究院医学研发中心的组织阵列仪，制成“胃肠道间质瘤多组织肿瘤芯片”，请病理科医生进行光镜观察，确保所选的标本符合要求。评定标准请中国医科大学附属盛京医院的病理学科有资质医生3名分别协助进行阅片，阅片者对组织切片的背景信息不了解，以其中结果相同的2位医生的评分为某组织点的得分。

1.3 免疫组织化学染色

兔抗人Claudin-4多克隆抗体（1∶400稀释，Thermo Scientific）；二抗（羊抗兔试剂盒，S-P 法，Labvision）。操作步骤按常规操作进行，以PBS代替一抗做阴性对照。

1.4 结果判定

（1）阳性细胞数量计0～4分：无计0分，≤25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计 4分；（2）染色强度计 0～3分：无色计 0分，浅黄色计 1分，棕黄色计 2分，棕褐色计 3分；（1）+（2）>3分计为阳性，≤3分计为阴性。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据分析采用χ2检验，Fisher确切概率法分析组间差异和相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织芯片构建情况

所有点阵排列整齐，HE染色基本无掉片、重叠和扭曲现象，免疫组化染色中无点脱落。

2.2 免疫组化结果

2.2.1 MMP-2，MMP-9染色结果：MMP-2，MMP-9主要表达于肿瘤细胞的细胞质中，阳性结果为胞质中出现棕黄色颗粒，正常对照无阳性表达（图1，图2）。2.2.2 MMP-2，MMP-9表达与临床病理指标的关系（表 1）

2.2.3 MMP-2，MMP-9表达水平的相关性：统计分析表明在GIST中MMP-2和MMP-9二者的表达存在正相关（r=0.716，P<0.05）。

表1G I S T中MMP-2，MMP-9的表达与临床病理特征的关系T a b.1T h ee x p r e s s i o na n dc o r r e l a t i o nt oc l i n i c a l p a t h o l o g i cf e at u r e s o f MMP-2，MMP-9i n G I S T Item n MMP-2 MMP-9Sex Male 64 41（64.06） 38（59.38）Female 60 40（66.67） 36（60.00）Age（year）≥55 70 45（64.29） 43（61.43）＜55 54 36（66.67） 31（57.41）Histological type Epithelial cell 28 19（67.86） 18（64.29）Usiform cell 73 48（65.75） 43（58.90）Mixed type 23 14（60.87） 13（56.52）Invasion and metastasis No 84 44（52.38）1） 41（48.81）2）Yes 40 37（92.50） 33（82.50）NIHⅠ63（50.00）3） 4（66.67）2）Ⅱ20 11（55.00） 10（50.00）Ⅲ37 23（62.16） 23（62.16）Ⅳ61 44（72.13） 37（60.66）Mucosal invasion No 79 44（55.70）1） 42（53.16）4）Yes 34 30（88.24） 28（82.35）1），2），P<0.05；3），4），P<0.01.

3 讨论

GIST的侵袭和转移是一个多阶段、多步骤的过程，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解及基底膜的破坏是肿瘤浸润和转移的先决条件［4］。肿瘤细胞必须具备降解ECM及基底膜的能力，而这一降解过程依靠蛋白水解酶，主要有丝氨酸蛋白酶类，半胱氨酸蛋白酶类和基质金属蛋白酶类［5］（matrix metallo proteinase，MMPs）。MMP-2，MMP-9是 MMPs中2个重要的酶，是能够降解Ⅳ型胶原的主要基质水解酶，它们一方面降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质和基底膜，使瘤细胞可沿着缺失的基底膜相周围组织浸润，促进肿瘤侵袭和和转移；另一方面可通过毛细血管内生、肿瘤新生血管生成等促进肿瘤生长和扩散［6，7］。

本研究结果显示，MMP-2，MMP-9在GIST中均存在高表达，而且随着NIH分级升高，MMP-2，MMP-9表达呈递增趋势，提示MMP-2，MMP-9的过度表达可以降解细胞外基质及基底膜，水解血管基底膜，使血管通透性增高，导致肿瘤的局部浸润和远处转移。本研究还发现MMP-2，MMP-9表达与患者的年龄、性别及组织学分型无明显相关性，而与肿瘤侵袭转移及NIH分级相关（表1）。说明MMP-2，MMP-9有促进肿瘤浸润和转移的作用。本研究结果还显示，在GIST中MMP-2，MMP-9表达呈正相关（r=0.716，P=0.042），提示2者在GIST的发生发展过程中的作用密切相关，可能有协同作用。

本实验中研究的MMP-2、MMP-9之间可以通过PI3K/Ak信号转导通路相互调节、共同参与GIST的发生发展。因此，我们认为MMP-2、MMP-9表达可能是GIST发生、侵袭、转移的重要指标，抑制其表达，阻断肿瘤的营养来源和转移通道，可望达到治疗肿瘤的目的。

［1］Qie S，Sun BC，Zhao XL，et al.Correlation between expressions of matrix metalloproteinase-2&9and vasculogenic mimicry in gastrointestinal stromal tumors［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2009，89（16）：1106-1109.

［2］Fisher JF，Mobashery S.Mechanism-based profiling of MMPs［J］.Methods Mol Biol，2010，622：471－487.

［3］Fletcher CD，Berman JJ，Corless C，et al.Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors：a consensus approach［J］.Int J Surg Pathol，2002，33（5）：81－89.

［4］Barkan D，Green JE，Chambers AF.Extracellular matrix：a gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth ［J］.Eur J Cancer，2010，46（7）：1181－1188.

［5］Naduk-Kik J，Hrabec E.The role of matrix metalloproteinases in the pathogenesis of diabetes mellitus and progression of diabetes retinopathy［J］.Postepy Hig Med Dosw，2008，62：442－450.

［6］Lamar JM，Pumiglia KM，DiPersio CM.An immortalization-dependent switch in integrin function up-regulates MMP-9to enhance tumor cell invasion［J］.Cancer Res，2008，68（18）：7371－7319.

［7］Am觍linei C，C觍runtu ID，Giusc觍SE，et al.Matrix metalloproteinases involvement in pathologic conditions［J］.Rom J Morphol Embryol，2010，51（2）：215－228.

（编辑孙宪民，英文编辑刘宝林）

Expression and It’s Significance of MMP-2，MMP-9in Gastrointestinal Stromal Tumor by Tissue Micro-array

ZHAO Ying1，ZHANG Tian-biao2，WANG Qiang1
（1.Gastro-intestinal Surgery and Nutrition Support Division，Department of Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Biochemistry and Molecullar Biology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the expression and it’s significance of MMP-2，MMP-9in human GIST.Methods124GIST specimens and their normal counterparts were used to detect protein expression of MMP-2，MMP-9.Result The positive expression of MMP-2was seen in 81cases of 124cases of GIST （65.3%）；the positive expression of MMP-9was seen in 74cases of 124cases of human GIST（59.7%）.The expression was closely related to NIH classification，mucosal invasion and metastasis.The positive correlation was observed in the 3genes.ConclusionThe expression of MMP-2，MMP-9was up-regulated in GIST and they might play an important role in the genesis and development of GIST.

gastrointestinal stromal tumor；tissue micro-array；immunohistochemistry；MMP-2；MMP-9

R735.2

A

0258-4646（2011）05-0444-03

doiCNKI：21-1227/R.20110523.1814.011

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1814.011.html

辽宁省教育厅高校科研计划（2009A726）

赵滢（1978-），女，讲师，硕士研究生.

王强，E-mail：wangq@sj-hospital.org

2011-03-01

网络出版时间：2011-05-1815：25