交感能受体阻断剂和去肾神经对5/6肾切除大鼠的肾脏保护作用

闵睿，王宗谦，陈望，赵欣欣，李艳浓，丁红

（中国医科大学附属第四医院肾内科，沈阳 110032）

交感能受体阻断剂和去肾神经对5/6肾切除大鼠的肾脏保护作用

闵睿，王宗谦，陈望，赵欣欣，李艳浓，丁红

（中国医科大学附属第四医院肾内科，沈阳 110032）

目的探讨交感能受体阻断剂与去肾神经对慢性进行性肾小球硬化（5/6肾切除大鼠慢性肾衰竭动物模型）的肾脏保护作用。方法 雌性Wistar大鼠40只，体质量为（200±10）g，随机分成4组，每组10只。阴性对照组行假手术（麻醉后行肾周包膜剥除术），术后2周开始灌服饮用水；阳性对照组行5/6肾切除术，术后2周灌服饮用水；交感阻断剂组行5/6肾切除术，术后2周灌服交感能受体阻断剂（阿尔玛尔20mg·kg－1·d－1）；去肾神经组行5/6肾切除术后2周行残肾去肾神经术（2周后开始灌服饮用水）。干预时间为8周。所有大鼠术后第2、4、6、8、10周用鼠尾测压仪测量大鼠血压并将大鼠置于代谢笼，留取24h尿液，之后以考马斯亮蓝法行尿蛋白定量检测；术后10周即实验结束时采血测定血红蛋白及生化指标；同时留取肾脏标本行肾脏病理、免疫印迹测定Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）、Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）及血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1-R），应用实时荧光定量PCR检测Col-Ⅲ、Col-Ⅳ及AT1-R的mRNA的表达。结果 与阴性对照组相比，阳性对照组大鼠的血压［（173.49±16.48）mmHg vs（118.67±13.34）mmHg）］和尿蛋白定量［（35.35±4.58）mg/24h vs（6.19±2.70）mg/24h）］均明显升高（P＜ 0.05），肾脏病理改变明显加重（P＜0.05），Col-Ⅲ、Col-Ⅳ和AT1-R及其mRNA的表达均明显增多（P＜0.05）；与阳性对照组相比，交感阻断剂组和去肾神经组大鼠的血压改善［（107.99±12.35）mmHg，（115.67±15.53）mmHg vs（173.49±16.48）mmHg）］，尿蛋白定量减少［（14.23±0.69）mg/24h，（16.49±3.77）mg/24h vs（35.35±4.58）mg/24h）］（P＜ 0.05），病理改变减轻，Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、AT1-R及其 mRNA的表达有不同程度的改善，其中尤以AT1-R的蛋白定量及其mRNA的表达明显减少（P＜0.05）；但两个干预组不论是血压、尿蛋白定量、血红蛋白水平、生化指标、病理改变还是Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、AT1-R水平以及其mRNA表达均无统计学差异（P＞0.05）。结论 交感能受体阻断剂和去肾神经均能够明显减轻和延缓5/6肾切除大鼠的肾小球纤维化、硬化，起到良好的肾脏保护作用。

慢性肾脏病；交感能受体阻断剂；5/6肾切除模型；去肾神经

慢性肾衰竭乃至尿毒症是常见病、多发病，在我 国每年约有10余万人罹患尿毒症，只有肾脏替代治疗才能维持尿毒症患者长期生存，然而无论透析或肾移植都相当昂贵，使医疗开支巨大，且至少半数以上的病人因经济所限而放弃治疗，劳动力损失极大。因此，防止各种慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）进展为尿毒症或终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）才是根本的防治措施。

众所周知，高血压和蛋白尿是CKD发生与发展最主要的两大独立危险因素。近年来，人们一直关注肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）在CKD发生与发展中的重要作用，通过使用血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）和（或）血管紧张素受体阻断剂（angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB）治疗 CKD，取得了一定的疗效，但十分有限。研究表明，交感神经系统（sympathetic nervous system，SNS）活性在 CKD的发生与发展中发挥着至关重要的作用［1，2］。一方面，交感神经兴奋使血压升高；另一方面，交感神经过度兴奋使RAS异常激活，从而加重高血压和蛋白尿，加速CKD进展。而且，交感异常活化与CKD心血管并发症密切相关。为此，我们通过制备慢性肾衰竭动物模型，分别给予交感能受体阻断剂或去肾神经，观察和比较其对肾脏的保护作用，为探索防治和延缓CKD发生与发展新的方法或手段提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂与仪器

阿尔玛尔（10mg×10日本住友制药株式会社）；Collagen IV抗体、CollagenⅢ抗体、血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensinⅡ subtype 1receptor，AT1-R）抗体 （1E10-1A9，abcam 公 司）；TIANScript RTKit（TIANScript cDNA第一链合成试剂盒）、RNAsimple total RNAKit总RNA提取试剂盒（天根）。鼠尾测压仪RBP-1B（北京中日友好临床医学研究所）；电泳系统 （电泳）DYY-10C、电泳系统（转印）DYCZ-24DN、凝胶成像系统WD-9413B型（北京六一）；超微量分光光度计NANODROP2000、紫外分光光度计NANO2000（美国Thermo）；荧光定量PCR仪（韩国BIONEER）；PCR仪（杭州博日仪器）。

1.2 实验对象及分组

雌性Wistar大鼠［实验动物生产许可证为：SYXK（辽）2003-0019，饲养许可证为：SYXK（辽）2003-0015］40只，体质量190～210g，随机分成4组，每组10只。阴性对照组行假手术，术后2周开始灌服饮用水（4mL·d-1）；阳性对照组行5/6肾切除术，术后 2周开始灌服饮用水（4mL·d－1）；交感阻断组行5/6肾切除术，术后2周开始灌服阿尔玛尔（20mg·kg－1·d－1，1mg·mL－1）；去肾神经组行 5/6肾切除术后2周参照文献［3］行残肾去肾神经术，术后2周灌服饮用水（4mL·d－1）。去肾神经术后如大鼠出现跛行或瘫痪，则剔除试验。

1.3 指标测定

1.3.1 一般检查：（1）尿蛋白定量：术后 2、4、6、8、10周，将动物置入代谢笼留取24h尿液，以考马斯亮蓝法行尿蛋白定量检测；（2）血压：术后 2、4、6、8、10周以套尾法测量大鼠血压，测量2次取平均值，按舒张压＋1/3脉压差的方法计算平均动脉压；（3）生物化学检测：术后10周（干预8周）后麻醉，经腹主动脉采血，留取血标本，行血红蛋白、总蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐测定。

1.3.2 肾脏病理检查：手术后第10周处死大鼠，摘除残肾后，切取适当大小组织块于4%甲醛溶液中固定2～4h。常规石蜡包埋，切取3μm石蜡切片，行HE染色。镜下观察病理变化并拍照。从系膜增殖、节段球硬化、球囊黏连等几个方面按-～+++4个等级半定量分析肾脏的病理改变。其中系膜增殖程度分级：“-”为无系膜增殖，“＋”为轻度系膜增殖，“++”为中度系膜增殖，“+++”为重度系膜增殖。节段肾小球硬化程度分级：“-”为无肾小球病变，“＋”为硬化节段＜25%，“++”为硬化节段介于25%～50%之间，“+++”为硬化节段＞50%。球囊黏连分级：“-”为无球囊黏连，“＋”为黏连范围＜25%，“++”为黏连范围介于25%～50%之间，“+++”为黏连范围＞50%。上述检测均由2位观察者对每个样本进行盲法评分，每个样本观察15～20个肾小球，阴性对照组每个样本观察12～15个肾小球。

1.3.3 免疫印迹：采用Western blot检测技术，相对定量分析残肾组织Ⅲ、Ⅳ型胶原及AT1-R的表达。用NP-40裂解液提取肾组织总蛋白，取30μg总蛋白上样行10%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，考马斯亮蓝染色，蒸馏水脱色，封闭。洗膜后加入一抗置于杂交袋中4℃孵育过夜。次日TTBS洗后加酶标二抗，37℃温箱孵育1h后复洗。取出后TTBS洗15min×4次。加入ECL工作液，将PVDF膜固定在暗盒内，暗室曝光1min。显影、停影、定影、冲洗、晾干。胶片放入成像系统拍照。

1.3.4 实时荧光定量PCR：采用Real-time PCR技术定量测定残肾组织中Ⅲ、Ⅳ型胶原及AT1-R的mRNA表达。利用RNAsimple total RNAKit提取试剂盒提取样本总RNA，利用TIANScript RTKit对RNA样本进行逆转录以得到对应的cDNA。利用得到的cDNA样本对actin和H-FABP引物进行PCR扩增，对得到的PCR产物进行电泳分析，并经凝胶成像系统拍照后进行荧光定量分析。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 尿蛋白定量

与阴性对照组比较，阳性对照组大鼠术后4、6、8、10周尿蛋白均逐渐增加，其中第6周开始明显增加。与阳性对照组比较，干预组大鼠尿蛋白排泄量均显著降低，但2组间无统计学差异（P＞0.05，表1）。

表15/6肾切除术后24h尿蛋白定量的比较（±s）Ta b.1Th e c o mp a r i s o n o f p r o t e i n u r i a p e r 24h a f t e r SNX（±s）1）P＜0.05vs negative control group；2）P＜0.05vs positive control group.

2.2 血压的变化

与阴性对照组比较，阳性对照组术后第6周开始血压升高，差异有统计学意义（P<0.05），之后第6、8、10周之间无明显升高。与阳性对照组比较，交感阻断组和去肾神经组大鼠的平均动脉压下降从术后第6周开始差异有统计学意义（P<0.05），第6、8、10周平均动脉压无明显下降，但2组间差异无统计学意义（表2）。

表25/6肾切除术后大鼠平均动脉压比较（±s）Ta b.2Th e c o mp a r i s o n o f MAPa f t e r SNX（±s）1）P＜0.05vs negative control group；2）P＜0.05vs positive control group.

2.3 生物化学检测结果比较

与阴性对照组比较，5/6肾切除术后10周，所有手术组大鼠血肌酐水平均明显升高（P<0.01），阳性对照组及干预组间比较血肌酐差异无统计学意义（P＞0.05）。各组间血红蛋白、尿素氮、白蛋白、总蛋白变化差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表35/6肾切除术后化验指标比较（±s）Ta b.3Th e c o mp a r i s o n o f Hb，Cr，BUN，TP，ALBa f t e r SNX（±s）

2.4 肾脏病理结果

5/6 肾切除大鼠肾脏组织出现肾小球系膜增生、小球节段硬化、球囊黏连、肾间质局灶淋巴细胞浸润及纤维化等病理改变，部分肾小管内可见蛋白管型。与阳性对照组比较，干预组大鼠残肾的病理改变均有程度不同的减轻，以去肾神经组大鼠病理改变最轻（表 4，图 1）。

表45/6肾切除术后病理改变Ta b.4Th e c o mp a r i s o n o f p a t h o l o g y a f t e r SNXMesangioproliferative FSGS Adhesions-＋+++++-＋+++++-＋+++++Negative control 140 105 27 8 0 118 15 5 2 125 10 4 1Positive control 180 96 38 35 11 108 22 38 121） 113 31 27 91）Sympathetic blocking agent 180 118 28 26 81） 121 32 19 81） 134 18 24 41）Renal denervation 180 117 30 27 61） 124 24 25 71） 132 25 18 51）Group n 1）P＜0.05vs positive control group.

2.5 Western blot检测结果

与阴性对照组比较，阳性对照组Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原以及AT1-R的表达均明显增加。与阳性对照组比较，所有干预组Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原以及AT1-R的表达均明显减少，以去肾神经组减少最明显（图2）。

2.6 Real-time PCR结果

结果显示，与阴性对照组相比，阳性对照组Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原以及AT1-RmRNA的表达均明显增加。与阳性对照组比较，所有干预组Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原以及AT1-RmRNA的表达均明显减少，以去肾神经组表达最少（表5～7）。

3 讨论

5/6 肾切除手术模型是一种慢性进行性肾小球硬化动物模型。本试验在术后第2周尿蛋白量开始增加，至术后第6周增加更明显，且出现血压的增高、肾功能的轻度异常以及早期肾小球硬化的表现，说明肾小球硬化动物模型制备是成功的。

表5各组Co l-ⅢmRNA的表达Ta b.5Th e e x p r e s s i o n o fCo l-ⅢmRNAGroup COL-Ⅲ-A Actin ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT Negative control 19.8574 17.1342 2.7233 0.0000 1.0000Positive control 18.9179 17.9588 0.9591 －1.7642 3.3968Sympathetic blocking agent 19.8938 18.7039 1.1898 －1.5335 2.8948Renal denervation 20.3935 18.8126 1.5809 －1.1424 2.2075

近年研究发现交感的异常激活参与了肾衰竭的进展，并且与患者的心血管风险存在显著的相关性，对于CKD的预后起到了很关键的作用［4］。大量的动物实验和临床证据证明，ESRD患者交感活性增高。CKD患者交感激活，其血浆儿茶酚胺水平明显增高［5，6］，儿茶酚胺可通过β肾上腺素受体介导的增殖作用以及对足突细胞的损伤导致肾脏的损害［7］。儿茶酚胺亦能诱导血管平滑肌细胞和血管外膜成纤维细胞的增殖，加速肾小球硬化的进展。切除慢性肾衰竭患者的双侧肾脏后其血压和交感活性恢复正常［1，2］，对肾衰竭模型进行双侧的去肾神经后也可显著地改善升高的血压［8］，提示交感的异常激活是由受损的肾脏所产生的。去除交感传出神经可能会增加肾脏血管的收缩［9］，并且去神经后尿钠排泄增多［10］可能导致RAS的激活，因此去肾神经尽量不要干扰传出神经；并且已经证实，仅仅去除肾脏的传入神经就可以达到抑制交感活性的作用［3］。因此我们试验选择的是去除肾脏的传入神经。肾上腺素能受体阻断剂亦能降低肾脏交感活性，达到肾脏保护作用。有很多的研究也显示了5/6肾切除模型中α及β受体阻断剂的肾脏保护作用。第三代的β受体阻断剂，例如卡维地洛和奈必洛尔，通过刺激NO的释放［11］，似乎比其他传统的β受体阻断剂具有更多的肾脏保护作用。

本试验中采用了第三代的β受体阻断剂——阿尔玛尔拮抗交感的激活，去肾神经选择的是脊神经后根切断术，去除肾脏的传入神经。与阳性对照组比较，2组尿蛋白排泄量明显减少，血压下降，肾脏病理改变相对较轻，代表肾脏纤维化硬化的Ⅲ、Ⅳ型胶原和AT1-R及其mRNA的表达减少。因此，我们推断，对慢性肾小球硬化模型进行交感阻断，不论是药物还是手术方法均能起到良好的肾脏保护作用。交感能受体阻断剂联合去肾神经是否具有更好的肾脏保护作用，尚有待进一步研究证实。

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（编辑 武玉欣，英文编辑 刘宝林）

The Renoprotective Actions of Sympathetic Blocking Agent and Renal Denervation in the Rat Renal Ablation Model

MINRui，WANGZong-qian，CHENWang，ZHAOXin-xin，LIYan-nong，DINGHong
（Department of Nephrology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo disscuss the renoprotective actions of the sympathetic blocking agent and renal denervation in the rat renal ablation model.Methods40wistar rats were randomly devided into 4groups.The first group served as negative control by sham operating.The second one as positive control by 5/6subtotal nephrectomy（SNX）.The third one was underwent SNX，The fourth group underwent SNXand resection of dorsal roots，i.e.rhizotomy.The negative control，the positive control group and the fourth group were administrated tap water，the third group was given sympathetic blocking agent for 8weeks.ResultsAt the end of the study，the blood pressure of the rats was 118.67±13.34mmHg in the negative control group，173.49±16.48mmHg in the positive control group，115.67±15.53mmHg in the third group and 107.99±12.35mmHg in the fourth group，respectively.Albuminuria was 6.19±2.70，35.35±4.58，16.49±3.77，14.23±0.69mg/24h，respectively.The glomerulosclerosis of the third and fourth group were better than that of the others.The lowest indices for collagen Ⅲ，collagenⅣ and AT1-Rwere found in the third and fourth group（P＜0.05）.ConclusionThe sympathetic blocking agent and renal denervation can protect the remanent kidney injury.

chronic kidney disease；sympathetic blocking agent；5/6subtotal nephrectomy；renal denervation

R692

A

0258-4646（2011）05-0400-05

doi CNKI：21-1227/R.20110523.1816.028

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1816.028.html

辽宁省教育厅高校科研计划（2008845）

闵睿（1976-），女，主治医师，硕士.

王宗谦，E-mail：zqw1813@163.com

2010-11-03

网络出版时间：2011-05-1815:25