HAART治疗与心理干预对HIV感染者外周血CD4+T细胞凋亡的影响

柏春琴，姚文虎，朱云鸿

（东南大学附属南京第二医院感染科，南京 210003）

HAART治疗与心理干预对HIV感染者外周血CD4+T细胞凋亡的影响

柏春琴，姚文虎*，朱云鸿

（东南大学附属南京第二医院感染科，南京 210003）

目的 观察高效抗逆转录病毒疗法（HAART）与心理干预对HIV感染者外周血CD4+T细胞内Ca2+浓度、细胞凋亡率、细胞线粒体膜电位的改变，探讨其对HIV感染者外周血CD4+T细胞凋亡的影响。方法 应用免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞，流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度，线粒体膜电位，细胞凋亡率。结果 HAART治疗心理干预对HIV感染者外周血CD4+T细胞凋亡百分率明显低于对照组，降低细胞内Ca2+浓度，提高线粒体膜电位，与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 HAART治疗可抑制HIV感染者外周血CD4+T细胞凋亡的发生，可能与其稳定线粒体膜电位，抑制细胞内钙超载作用相关。

HIV；CD4+T细胞；HAART治疗；心理干预；凋亡

国内外研究发现HIV感染可能增加了CD4+T细胞的凋亡率[1,2]。这种变化提示CD4+T细胞凋亡可能参与HIV感染的致病性和AIDS的发病机制。体外研究发现HIV感染者CD4+T细胞凋亡率较正常对照明显升高[3]，感染早期血中病毒滴度很高，而后在CTL细胞和抗HIV抗体共同作用下维持在一个稳定的低水平，并在2～10年内保持平衡，HIV蛋白、激活诱导的细胞死亡（AICD）、细胞因子生成紊乱打破了这种平衡，CD4+T细胞进行性凋亡，淋巴细胞破坏增加后，为了维持T细胞的稳态，机体大量初始细胞被激活，一方面可转化为记忆T细胞，另一方面其大量活化又促进了AICD的产生，最终导致CD4+T细胞被耗竭。可见积极抗病毒治疗，阻止免疫细胞的凋亡对AIDS患者免疫重建有重要作用[4]。

HAART抗病毒治疗是艾滋病最根本的治疗，而HAART是目前艾滋病抗病毒治疗的标准疗法。HAART的应用显著降低了艾滋病的发病率和病死率，改变了HIV感染的自然史，使艾滋病从一种致死性的亚急性感染成为一种可以控制的慢性疾病。慢性病毒感染，可以导致淋巴细胞表面PD-L1的表达上调，降低免疫功能，而阻断PD-L1，可以提高淋巴细胞的抗病毒能力[2]。虽然HAART尚不能将HIV病毒从体内完全清除，但可以尽可能地长期抑制病毒复制，将病毒载量控制在现有方法无法检测的水平（＜50拷贝/mL），帮助患者重建免疫功能，提高患者生存质量和存活率，延长患者的寿命。有研究对比HAART问世前后艾滋病患者的病死率后发现，HAART使HIV感染者的病死率从1996年至1999年的1.63%下降到了2003年至2005年的1%。如果患者自20岁起开始接受HAART，寿命将从36.1岁延长至49.4岁。HIV感染者经过积极的抗病毒治疗，寿命可达正常人的2/3[1]。近年来，佑安医院的主任医师张可说：“20岁感染HIV病毒者可活到63岁，40岁感染HIV病毒者可活到73岁。”

心理干预：HIV感染者/AIDS患者是一部分特殊人群，疾病对他们生理造成严重影响的同时，其心理问题也日益突出，心理危机出现的概率逐渐升高，而心理干预可以体现人类尊严和提高其生存质量[3]。有效的心理护理在辅助治疗中占有重要的席位，心理干预措施把病人作为一个整体看待，从生理、心理、社会多方收集资料，作为整体干预的依据，既运用生物医学的知识和技术，又充分运用心理因素的作用规律和心理治疗的技术进行多层次的系统干预，其有效性逐步得到确认[4，5]。目前越来越多的研究和临床观察证实：以减少应激为目的的心理干预能不同程度地提高免疫功能的某个方面，尤其是能增加外周循环中自然杀伤细胞活性，增加T细胞对外来物的吞噬作用，减少抑制/毒性T细胞数量，使辅助/诱导T细胞数量增加，淋巴细胞转化以及细胞因子增加等[6]。

1 资料与方法

1.1 实验对象

随机选取未抗逆转录病毒治疗的CD4+T细胞300～414个/µL的HIV感染者20例。

1.2 分离CD4+T细胞

采集肝素抗凝外周血20 mL，淋巴细胞分离液（上海索莱宝生物科技有限公司产品）分离单个核细胞、用免疫磁珠法（上海源叶生物科技有限公司）分离CD4+T细胞；含10%胎牛血清的1640培养液（Gibco公司产品）培养，处理组加入红景天苷（终浓度3μmol/L，购自中国药品生物制品检定所），对照组加等量生理盐水。

1.3 凋亡率检测

Annxin-V分析 使用FITC标记的Annexin-V和PI双染法检测细胞凋亡，根据晶美生物工程有限公司提供的说明书进行操作。即取2万个细胞，经4℃ PBS漂洗两次，弃上清，加入250 µL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞。取100 µL移入流式细胞仪专用试管，加入5 µL AnnexinV-FITC、10 µL碘化丙啶染色液轻轻混匀。室温（20～25）℃避光孵育15 min。加入400 µLPBS轻轻混匀，用流式细胞仪进行分析。

1.4 胞内游离钙的测定

Fluo-3AM（碧云天生物生物技术研究所产品）是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，以荧光强度表示钙离子浓度。收集细胞，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，用新鲜培养基，加入Fluo-3AM（终浓度为5 μmol/L）的培养液重悬细胞，37℃温育60 min，PBS洗细胞3次，留细胞悬液1 mL，在流式细胞仪上分析。（激发波长为488 nm，发射波长为526 nm和620 nm）。

1.5 线粒体跨膜电位（Δψm）检测

JC-1（碧云天生物生物技术研究所产品）在线粒体膜电位较高时聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。取5万细胞，重悬于0.5 mL细胞培养液中，加入0.5 mL JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20 min。600 g 4℃离心3～4 min，沉淀细胞，弃上清，用冰浴的JC-1染色缓冲液洗涤2次，再用0.4 mL JC-1染色缓冲液重悬后，用流式细胞仪分析。（JC-1单体、聚合物激发波长分别为：510 nm，580 nm发射波长：530 nm，590 nm）。

1.6 统计学分析

实验结果以SPSS 11.0软件分析实验结果。胞内钙离子浓度比较用方差分析，其余组间用WilcoxonW秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

HIV感染者外周血CD4+T细胞培养24 h后，HAART治疗组的细胞凋亡率（8.03±0.65）%显著低于对照组（11.16±1.24）%，反应线粒体膜电位崩溃的绿色荧光细胞比率（10.25±0.97）%低于对照组（14.62±2.03）%，培养12 h时后HAART治疗组反应胞内钙离子浓度的Fluo-3荧光强度（87.14±23.0）低于对照组（103.57±21.49）。（表1）。

表1 HAART治疗与心理干预后细胞凋亡率、线粒体膜电位、胞内钙浓度改变（）

表1 HAART治疗与心理干预后细胞凋亡率、线粒体膜电位、胞内钙浓度改变（）

注：两组比较，P＜0.05。

凋亡率（%） JC-1绿色荧光细胞（%） Fluo-3荧光强度对照组 11.16±1.24 14.62±2.03 103.57±21.49处理组 8.03±0.65 10.25±0.97 87.14±23.05

3 讨论

HIV感染可通过多种直接或间接的病理机制使CD+4T淋巴细胞数量进行性减少，减少的原因主要包括HIV直接杀伤细胞，HIV诱导CD+4T淋巴细胞凋亡，补体介导的细胞毒效应及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。研究表明，HIVgp120等抗原组份可与CD4受体结合，激活钙通道，使胞内Ca离子浓度增高，从而影响胞内正常信号传导，导致CD4+T细胞凋亡[6]。有学者认为这是HIV感染导致CD+4T淋巴细胞数目减少的主要原因[7,8]本次研究发现HAART治疗与心理干预HIV感染者外周血CD4+T细胞共培养24 h后胞内钙浓度较对照低，同时凋亡率下降。对于淋巴细胞而言，Ca2+不仅可以参与细胞凋亡的调节，其浓度升高还是淋巴细胞激活和增殖早期呈现的一个重要现象。推测HAART治疗有提高介导细胞发生凋亡的细胞内Ca2+浓度的阈值的作用，从而淋巴细胞进入活化增殖阶段，导致凋亡的淋巴细胞所占的比例下降[9]。

线粒体是细胞能量代谢的中心，细胞凋亡过程中含BH3结构域的Bcl22家族成员Bid、Bad、Bim、Harikari、Noxa等在接受到胞内的死亡信号后激活。这些含BH3结构域的Bcl-2家族成员与另（Bax亚家族成员Bax，Bak等，主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆）作用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素C（Cytc）和其他蛋白[10]，而Cytc的释放是线粒体凋亡路径的主要步骤。Jacotot[11]等证明，HIVvpr蛋白主要通过线粒体途径诱导细胞凋亡。本实验中发现HAART治疗与心理干预抑制了线粒体膜电位的崩溃，减少凋亡发生率。

综上所述HAART治疗与心理干预能抑制HIV感染者外周血CD4+T细胞的凋亡发生率，可能通过抑制钙内流和线粒体膜电位崩溃实现[12]。

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HAART treatment for HIV infections with psychological intervention CD4+T peripheral blood cell apoptosis infl uence

BAI Chun-qin,YAO Wen-hu,ZHU Yun-hong
(Southeast university hospital affi liated nanjing second,Nanjing 210003,China)

HIV;CD4+T cells;HAART treatment;Psychological intervention;apoptosis

R373.3

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.04.006.017.03

2010－12－20

柏春琴（1968－），女，江苏人，本科在读，主管护师，主要从事临床护理工作。

〔作者简介〕*姚文虎，主任医师，教授。

马宏宇）