均匀设计法优化柔红霉素发酵培养基

潘淑勇

(鲁南制药集团股份有限公司，山东临沂276006)

临床上盐酸柔红霉素是治疗急性非淋巴细胞性白血病的一线药物，对儿童白血病也有良好的缓解作用，同时也是去甲氧柔红霉素、阿霉素和表柔比星的合成起始原料。随着人类癌症发病率的逐年上升，盐酸柔红霉素的市场容量也在快速提高。2009年柔红霉素、阿霉素和表柔比星均被收录到《国家基本医疗保险药品目录》。然而较低的发酵效价造成了昂贵的生产成本，致使售价居高不下。降低生产成本，减少患者的负担是我们当前迫切需要解决的问题。

1978年王元和方开泰提出了均匀设计，该设计考虑如何将设计点均匀地散布在试验范围内，使得能用较少的试验点获得最多的信息。多年来，均匀设计在国内得到了广泛应用，并获得不少好的成果。本次研究将采用均匀设计的方法，优化柔红霉素的发酵培养基，以期进一步提高发酵效价，降低生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 亲本:Dau G22:发酵效价为2 198 mg·L－1。保存于鲁南制药科研部。

1.1.2 培养基 种子摇瓶培养基:玉米淀粉4.0%，葡萄糖1.0%，麸皮1.0%，麸质粉0.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO40.1%，CaCO30.4%，pH自然。装60 mL于500 mL摇瓶中，121℃灭菌30 min。

发酵摇瓶培养基:玉米淀粉7.0%，麸皮1.0%，麸质粉0.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%;pH自然。装30 mL于250 mL摇瓶中，121℃灭菌30 min。

1.1.3 色谱条件 高压液相色谱Agilent C18色谱柱(53 mm ×7 mm，3 μm);流动相:15 mmol·L－1的磷酸二氢钾－乙腈(1∶1);柱温25℃;流速1.0 mL·min－1;检测波长:254 nm。

1.2 方法

1.2.1 实验方法 将Dau G22的工作细胞库接入种子摇瓶，接种量1 mL，于29℃摇床中220 rpm培养42 h。再转接到发酵摇瓶培养基中，接种量10%，每个菌株接种3个摇瓶，于28℃摇床中220 rpm培养168 h。高压液相测定效价。

1.2.2 实验设计 发酵摇瓶培养基设计采用均匀设计表U*10(108)，S=3，D=0.168 1，见表1［1］。

表1 ，S=3

表1 ，S=3

1 5 6 1 1 5 7 2 10 3 3 3 4 10 2 4 4 9 6 5 5 3 2 6 6 8 9 7 7 2 5 8 8 7 1 9 9 1 8 10 10 6 4

将发酵摇瓶培养基的玉米淀粉、麸皮、麸质粉3种成分作为3个因素进行10水平的实验，各因素水平分布见表2。

表2 各因素水平分布

1.2.3 数据分析 计算平均效价，数据分析使用SAS 9.0软件，做二次曲面回归，得出最佳配方。

1.2.4 验证 将分析得到的配方用摇瓶发酵进行验证。

2 结果与分析

2.1 摇瓶发酵实验结果 实验结果见表3。

2.2 数据分析 使用SAS软件做二次曲面回归得到回归方程:Y=－6 396.5+1 977.1［玉米淀粉］+5 559.6［麸皮］－8 560.7［麸质粉］+6.3［玉米淀粉］2－1 670.6［玉米淀粉］×［麸皮］－217.7［玉米淀粉］×［麸质粉］+10 355［麸皮］×［麸质粉］

显著性影响见表4。

表3 摇瓶发醇实验结果

表4 3个因素的F值和P值

P值均 ＜0.5，因此3个因素对发酵效价均有显著影响。

SAS预测当［玉米淀粉］=12.4%，［麸皮］=1.1%，［麸质粉］=1.5%时发酵效价达到最大为:2 606 mg·L－1

2.3 发酵效价的验证 根据分析结果，使用如下培养基再次发酵验证预测准确性:玉米淀粉12.4%，麸皮1.1%，麸质粉1.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%; pH自然。实验方法同上所述。

验证实验结果见表5。

表5 优化后培养基摇瓶发酵效价

验证实验最高发酵效价为2 703 mg·L－1，比原培养基发酵效价提高23%，SAS预测结果较为准确。

3 小结

均匀设计是我国科学家自主发明的一种优秀的设计方法，在我国的火箭等尖端科学研究中发挥了重要的作用，我们应用均匀设计实现了柔红霉素发酵培养基的改良，为进一步降低生产成本，提高市场竞争力，降低患者负担发挥了一定的作用。

［1］ 峁诗松，王静龙，史定华.统计手册［M］.北京:科学出版社，2003:751.